牛白细胞干扰素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗牛病毒性疾病的牛白细胞干扰素的制备方法。实施步骤如下：（１）无菌采集牛血，加入抗生素和抗凝剂，４．０℃冰箱放置；以２０００－４０００ｒｐｍ离心牛血，收集灰黄层，用培制好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ｍｌ含１×１０↑［５］－１×１０↑［７］；（２）白细胞悬液中加入少量干扰素，于３７℃水浴搅拌培养２－３小时；（３）在启动的白细胞悬液中再加入适量诱生剂新城疫病毒，使其最终浓度为１２８－１２８０血凝单位／ｍｌ，３７℃摇床搅拌培养１８－２４小时；（４）待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至ｐＨ２．０，４．０℃，放置１－４天，灭活病毒，再加ＮａＯＨ调至ｐＨ７．０，即得粗制牛白细胞干扰素。本产品注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠，用量低、无毒副作用和成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，具体地说，是涉及一种治疗牛病毒性疾病的牛白 细胞干扰素的制备方法。技术背景随着国民经济的飞速发展及农业产业结构的科学调整，奶牛.业成了畜牧 业中发展速度最快的一个热点产业。在奶牛业飞速发展的大好背景下，奶牛 的流动性大大增加，奶牛的集约化生产程度和泌乳性能进一步提高，奶牛疾 病对奶生产所造成的影响变得越来越突出。如何有效防治奶牛疾病、减少经 济损失，成为大家非常关心的问题之一。病毒传染病是奶牛的大规模杀伤性 疾病。病毒传染病主要包括牛病毒性腹泻一黏膜病、口蹄疫、牛流行热、牛 流行热、蓝舌病、疯牛病等。例如，牛病毒性腹泻或称牛粘膜病是牛的一种 重要的传染病。以发热、白细胞减少、口腔及消化道粘膜糜烂、坏死和腹泻 为特征,但大多数牛是隐性感染。牛病毒性疾病仍是当前严重制约养牛业健康发展的主要传染病。全国每 年均有上千万头牛在不同季节发生病毒性传染病。牛一旦感染发病，则有起 病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点， 对养殖业危害极大。牛病毒性疾病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近 年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗牛病毒性疾病的试验，但治愈 率较低。抗生素及磺胺类药物基本无效。目前，牛干扰素是治疗牛病毒性疾病 的有效药物。干扰素的抗病毒作用并不是直接作用于病毒，而是通过与细胞 受体连接，诱导细胞产生另一类蛋白质而发挥效能。这些蛋白质又称抗病毒蛋白。主要包括蛋白激酶、2—5合成酶等。这些酶可以使病毒蛋白合成受抑 制，使病毒降解。干扰素抗病毒具有以下特点1、干扰素抗病毒不是杀灭而是抑制病毒， 一旦招i去干扰素，病毒往往又重新繁殖。只有用足够浓度的干扰素，长期使用，才有可能将其彻底消灭。 这就是为什么干扰素需要长期治疗的原因所在。2、 干扰素具有种属特异性，人干扰素一般只用于治疗人的疾病。3、 不同的细胞种类和不同的动物、不同的病毒感染类型对干扰素的敏感 性不同。所以，各种类型的干扰素临床疗效也有所不同。目前，白细胞干扰素研发工作已取得重大突破，现在养殖场和动物医院广泛使用有猪细胞干扰素和禽基因工程干扰素。结果证明，其疗效优于市场现有的其它产品的效果。95111427.1提供一种猪白细胞干扰素注射剂及其制备方法； 02138397.9提供一种重组y -干扰素预防和治疗奶牛隐性乳房炎的方法； 200410065926.5提供一种猪白细胞干扰素的制备方法； 200610124195.6提供一种猪p干扰素重组腺病毒及其构建方法和应用； 200610124194.1提供一种猪a干扰素重组腺病毒及其构建方法和应用； 200610130621.7提供一种牛y-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定的方法。但有关利用牛血制备牛白细胞干扰素的方法还未见报道。因此，提供一种有效预防和治疗牛病毒性疾病的，是该
科研人员急需开发的新课题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种牛白细胞干扰 素的制备方法。为实现上述目的本专利技术所采用的实施方式如下 一种，其特征在于具体实施步骤如下(1) 无菌采集牛血，加入10pg/ml卡那霉素和适量抗凝剂，4.0。C冰箱放 置；以加004000rpm离心牛血，收集灰黄层，用培制好的培养液稀释细胞沉 淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含l x 105-1 x 107;(2) 白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为100-600单位/ml， 于37。C水浴搅拌培养2-3小时；(3) 在启动的白细胞悬液中再加入适量诱生剂新城疫病毒，使其最终浓 度为128-1280血凝单位/ml， 37。C摇床搅拌培养18-24小时；(4) 待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0， 4.0 。C，放置l-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0,即得粗制牛白细胞干扰素。本专利技术的有益效果是猪基因工程干扰素具有制备成本高，在临床推广 中受到很到限制。本专利技术利用牛血制备牛白细胞干扰素的方法其具有很多 优点制备成本低，使用剂量低，疗效好。牛白细胞干扰素含有a干扰素和卩 干扰素，如果成功地解决了血源来源和血源污染等问题，在保证质量的前提 下，利用牛血制备牛白细胞干扰素能够降低了药物的成本。因此该产品具有 巨大市场前景和很好的经济效益。本产品注入动物机体后，具有疗效好、安 全可靠、用量低、无毒副作用和成本低等优点。其功能是作为一种广谱抗病 毒作用，能够治疗牛病毒性腹泻，牛口蹄疫等病毒性疾病。临床试验总治愈 率为82.2%以上，人工控制治疗牛口蹄疫和牛病毒性腹泻总治愈率分别为81.3 %和95.2%。具体实施方式以下结合实施例，对依据本专利技术提供的具体实施方式详述如下 实施例1，具体步骤如下(1) 白细胞制备无菌采集牛血，加入抗生素和抗凝剂，4.0。C冰箱放置。以2000-4000rpm 离心牛血，收集灰黄层，用培制好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度 稀释为每ml含1 xio6。白细胞的分离应在采血后48小时内进行。活细胞数应 达到90%以上。(2) 诱生病毒采用新城鸡瘟病毒(NDV) F抹，血凝效价达到适宜滴度方可投产。 (3 )培养液釆用RPMI-1640，内含适量牛血清和10)ig/ml卡那霉素或庆大霉素，也可 用其它适宜培养液。(4) 生产用原水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。(5) 粗制干扰素的制备工艺 (5.1 )诱生病毒的制备采用9-10日龄健康鸡胚，于每胚的尿嚢腔内接种适量新城疫病毒，37。C培 养48-72小时，鸡胚发育良好，病毒达到适宜滴度后，收集尿嚢液，并做无菌 试验，检验合格后合并，抽样做效价测定，放-2(TC待用。(5.2) 白细胞悬液用离心法分离血浆，吸取白细胞层，然后用步骤(3)中配置的培养液稀 释，以每ml含5xl(^为宜。(5.3) 起动与诱生 ，白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素，使其最终浓度为400-600单位/ml， 于37。C水浴搅拌培养2小时，再加入512-1026血凝单位/ml新城疫病毒进行诱 生，待干扰素达到最高峰时，收集上清，将上清经酸化和中性化后灭活病毒， 即为粗制牛白细胞干扰素。(5.4) 待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至pH2.0, 4.0 。C,放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0,即得粗制牛白细胞干扰素。(5.5) 离心收集上清即得粗制白细胞干扰素，放-20。C保存。 实施例2，具体步骤如下(l)无菌采集牛血，加入10pg/ml青霉素、链霉素和适量抗凝剂，4.0°C 水箱放置。以2000-4000rpm离心牛血，收集灰黄层，用配置好的1640培养基 稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ml含1 x io7。(2 )在白细胞悬液中加入4-8%牛血清或血浆，混匀。(3 )在上述白细胞悬液中加入少许干扰素，使其最终浓度为200-300单位 /ml,于37。C水浴搅拌培养3小时。(4 )在启动的白细胞悬液中再加入256-512血凝单位/ml新城疫病毒进行 诱生，37。C摇床搅拌培养12-24小时。(5 )待干扰素达到最高峰时，以2000-4000rpm离心，离心收集上清，加 入盐酸调至pH2.0, 4.0°C,本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛白细胞干扰素的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：　　　　（１）无菌采集牛血，加入１０μｇ／ｍｌ卡那霉素和适量抗凝剂，４．０℃冰箱放置；以２０００－４０００ｒｐｍ离心牛血，收集灰黄层，用培制好的培养液稀释细胞沉淀物，使白细胞浓度稀释为每ｍｌ含１×１０↑［５］－１×１０↑［７］；　　　　（２）白细胞悬液中加入少量干扰素，使其最终浓度为１００－６００单位／ｍｌ，于３７℃水浴搅拌培养２－３小时；　　　　（３）在启动的白细胞悬液中再加入适量诱生剂新城疫病毒，使其最终浓度为１２８－１２８０血凝单位／ｍｌ，３７℃摇床搅拌培养１８－２４小时；　　　　（４）待干扰素达到最高峰时，离心收集上清，加入盐酸调至ｐＨ２．０，４．０℃，放置１－４天，灭活病毒，再加ＮａＯＨ调至ｐＨ７．０，即得粗制牛白细胞干扰素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：古长庆，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]