【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法及其产品和应用。
技术介绍
1、脊髓是维持人体正常生理活动的重要神经组织，然而由于外伤等导致的脊髓损伤一直威胁着人类的正常生活。更为严重的是，神经系统自我修复能力较弱，且临床缺乏对脊髓损伤的有效治疗手段，导致损伤后的病程会十分漫长甚至伴随患者一生。过去的几十年中，中国的脊髓损伤发病率急剧上升，在所有外伤发生中占比0.74％，其中绝大部分损伤由交通事故或高空掉落导致。严重的损伤通常会导致患者下肢瘫痪，损伤部位上移会造成高位截瘫甚至死亡，极大地影响患者生活质量，同时会消耗大量人力物力，为患者家属和社会造成负担。因此，开发安全、有效、可治愈的脊髓损伤治疗手段迫在眉睫。
2、基于支架的脊髓损伤治疗在临床前研究中被广泛使用报道，展现出了良好的应用前景。以人工聚合物材料或天然聚合物材料为基质，合成用于损伤部位植入的支架，可加强对损伤部位的支撑，减少局部组织的坍缩；使用天然聚合物材料，如透明质酸、胶原、明胶、壳聚糖等合成的支架，在具备良好生物相容性的同时，还可为脊髓损伤后损伤部位及周边补充外源性细胞外基质，发挥一定的微环境调节作用；同时，根据不同目的，还可以在对支架进行修饰，使其具炎症调节、氧化调节、促神经再生等作用；此外，支架还可以作为药物储库，携载甲基泼尼松龙、米诺环素、干细胞等治疗物质，在局部释放，避免系统性注射导致的潜在副作用，并提高局部药物浓度。
3、促进神经再生是脊髓损伤一大治疗策略，而目前促进脊髓损伤后神经再生的方法较为有限。基于支架
4、由于脊髓损伤并称复杂漫长，除了促进神经再生，对局部恶劣微环境的调节也具有重要意义。外泌体被认为是各种细胞发挥生理作用的关键。干细胞来源的外泌体的内部包含丰富物质，如dna、mrna、mirna、蛋白质等，可发挥显著的抗炎、抗凋亡和抗活性氧作用。同时，细胞来源使其拥有较低的免疫原性，是较为理想的治疗物质，提纯干细胞的外泌体更有望实现组织损伤的高效修复，并已经在脊髓损伤的临床前研究中发挥了良好的治疗效果。
5、因此，如何提供一种更加优异的促脊髓损伤恢复功能的支架是目前本领域的研究热点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，制备方法简单，形成的支架具备优异的促脊髓损伤恢复功能。
2、本专利技术提供如下技术方案：
3、一种携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
4、(1)对支架基质进行肽修饰，得到肽修饰支架基质；
5、(2)将含有不同浓度的肽修饰支架基质的溶液根据距离梯度变化，通过光交联固化，得到肽梯度支架；
6、(3)以肽浓度梯度方向为轴向，将肽梯度支架加工为卷形结构，得到卷形肽梯度凝胶支架；
7、(4)对卷形肽梯度凝胶支架进行外泌体携载，得到携载外泌体的卷形肽梯度支架。
8、本专利技术提供的携载外泌体的卷形肽梯度支架中肽浓度最高的一端贴合脊髓损伤上游切面，使梯度和神经生长方向一致。
9、本专利技术提供的携载外泌体的卷形肽梯度支架中的卷形结构通过多层结构，可发挥类似孔道的作用，利用层间空隙，加强神经再生；在支架表面的进行梯度促神经黏附多肽修饰，促进细胞在该方向上的迁移，可对神经元以及轴突延伸发挥引导作用；在此基础上，利用外泌体发挥抗炎抗凋亡作用，减少损伤部位神经元凋亡，调节局部免疫微环境，可助力长期脊髓损伤恢复。
10、在步骤(1)中，所述支架基质选自甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠中的一种或多种。
11、在步骤(1)中，所述修饰的肽为多肽(层粘连蛋白来源的多肽)，所述多肽选自rgd、yigsr、ikvav、pdsgr、cqaasikvav中的一种。通过对支架基质进行肽修饰，其中肽可促进神经黏附，增强其对神经元及轴突的黏附性。
12、在步骤(1)中，所述支架基质上的多肽修饰量为1-10mg/100mg。若修饰量过小，无法达到促进神经元及轴突黏附的作用；若修饰量过大，神经元及轴突黏附过强，无法在支架中实现延伸。
13、优选的，在步骤(1)中，所述支架基质上的多肽修饰量为2.5-5mg/100mg。在这个范围内，具有相对较好的促进神经元及轴突黏附的作用，更利于其在支架中实现延伸。
14、在步骤(2)中，将肽修饰支架基质的浓度根据距离梯度变化：支架基质和肽修饰支架基质混合得到含有不同浓度的肽修饰支架基质的溶液，含有不同浓度的肽修饰支架基质的溶液以一定间隔(如1mm)注入模具中孵育5-30s(如置于37℃中)。若孵育时间过短，将导致肽浓度变化剧烈，无法形成均匀变化的梯度；若孵育时间过长，将导致梯度扩散。
15、在步骤(2)中，梯度支架中，肽修饰凝胶(肽修饰支架基质)的浓度为0.5-20％。若浓度过低，无法促进神经细胞的黏附；若浓度过高，神经细胞黏附过强，将导致迁移受阻。
16、在步骤(2)中，所述光交联固化的时间为15-45s。若交联时间过短，凝胶交联不充分，机械强度不足，无法加工为卷形结构；若交联时间过长，凝胶韧性不足，在加工过程中易断裂，亦无法形成卷形结构。
17、在步骤(4)中，所述外泌体选自脐带来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、神经干细胞。
18、外泌体携载方法为以下至少一种：外泌体悬液共孵育、自然风干后溶胀、真空干燥后溶胀、冷冻干燥后溶胀。
19、在步骤(4)中，所述携载外泌体的卷形肽梯度支架中泌体携载量为50-200μg。外泌体携载量过小，不足以达到调节炎症，减少神经凋亡的效果。
20、本专利技术还提供了一种根据上述制备方法得到的携载外泌体的卷形肽梯度支架。
21、本专利技术还提供了上述携载外泌体的卷形肽梯度支架在脊髓损伤中的应用。本专利技术提供的携载外泌体的卷形肽梯度支架可促进脊髓损伤后神经再生，并通过外泌体调节脊髓损伤急性期，减少神经元凋亡调节炎症，加强长期神经再生作用。
22、本专利技术也可以用于促进其他细胞的迁移。
23、本专利技术与现有技术相比，主要优点包括：
24、本专利技术提供的制备方法无需使用3d打印等技术，使用光交联方法使支架易于加工和形成肽梯度，通过浓度变化和外泌体携载量即可得到具有特殊结构的支架；本专利技术形成的支架可显著促进神经元的延伸，无额外药物的情况下即可促进脊髓损伤的修复；同时，使用外泌体为治疗制剂，具备良好的疗效与生物安全性；相关支架基质均有上市产品，具有良好的生物相容性；外泌体和支架可产生协同作用，达到更好的治疗效果。
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1.一种携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述支架基质选自甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述修饰的肽为多肽，所述多肽选自RGD、YIGSR、IKVAV、PDSGR、CQAASIKVAV中的一种。
4.根据权利要求3所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所示支架基质上的多肽修饰量为1-10mg/100mg。
5.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将肽修饰支架基质的浓度根据距离梯度变化：将支架基质和肽修饰支架基质混合得到含有不同浓度的肽修饰支架基质的溶液，含有不同浓度的肽修饰支架基质的溶液以一定间隔注入模具中孵育5-30s。
6.根
7.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述光交联固化的时间为15-45s。
8.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述外泌体选自脐带来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、神经干细胞；所述携载外泌体的卷形肽梯度支架中泌体携载量为50-200μg。
9.一种根据权利要求1-8任一所述的制备方法得到的携载外泌体的卷形肽梯度支架。
10.一种权利要求9所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架在制备治疗脊髓损伤产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述支架基质选自甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述修饰的肽为多肽，所述多肽选自rgd、yigsr、ikvav、pdsgr、cqaasikvav中的一种。
4.根据权利要求3所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所示支架基质上的多肽修饰量为1-10mg/100mg。
5.根据权利要求1所述的携载外泌体的卷形肽梯度支架的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将肽修饰支架基质的浓度根据距离梯度变化：将支...
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