本发明专利技术公开了一种基因NAT1和bHLH110在提高水稻高温抗性中应用，通过基因编辑技术获得高温抗性提高水稻材料。水稻基因NAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因bHLH110的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。通过基因编辑技术对水稻的水稻基因NAT1的碱基替换、缺失或插入碱基，解除对水稻的基因bHLH110的抑制，水稻的基因bHLH110促进蜡质合成基因CER1及CER1L表达使植株高温抗性增强，制备高温抗性增强的水稻材料。本发明专利技术利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得的NAT1突变体水稻材料日本晴在高温抗性方面显著增强，包括幼苗期存活率及生殖期农艺性状提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及水稻基因nat1和bhlh110在提高水稻高温抗性中应用。
技术介绍
1、近些年随着工业化快速发展，温室气体排放加剧导致气温升高，给植物生长、农业生产带来巨大挑战。例如，2022年七月份高温席卷全国，多省陷入高温炙烤之中，连日遭遇40摄氏度以上高温。据估算，全球平均气温每升高1℃，水稻、小麦、玉米等主要粮食作物就会减产3-8％(zhao et al.,2017.temperature increase reduces global yields ofmajor crops in four independent estimates.proc.natl.acad.sci.usa,114:9326-9331)。世界粮农组织曾发表声明：由于气候变化，自2007年起，全球粮食产量下降了30％，且这种状况还在进一步恶化。水稻是我国主要粮食作物且大面积种植，对国家发展至关重要。农作物在生长过程中面临着诸多逆境，包括非生物胁迫和生物胁迫，但植物无法通过移动等手段来规避，只能调控生理生化代谢从而做出有效应答。研究水稻对高温胁迫的响应分子机制，创制耐高温育种材料，不仅是植物与环境互作的基础科学问题，也是我国实现种业振兴的国家重大战略需求。
2、本专利技术则是鉴定了一个负向调控因子nat1(negative regulator ofthermotolerance)，其突变体表现出高温抗性的特征。在分子机制上，nat1突变体表现出蜡质含量上升而增强高温抗性，这一过程是基因bhlh110介导实现的。
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br/>技术实现思路
1、本专利技术提供了一种基因nat1和bhlh110在改良水稻高温抗性方面的应用，通过基因编辑技术获得高温抗性提高水稻材料，且不含转基因成分。本专利技术涉及的nat1基因是水稻7号染色体上一个锌指转录因子基因，编号为os07g0590100(rap编号)或loc_os07g40080(msu编号)。nat1 dna全长894bp，1个外显子，序列如seq id no.1所示。编码区cds全长606bp，序列如seq id no.2所示；编码202个氨基酸，具体序列如seq id no.3所示。nat1蛋白含有两个锌指结构域，一个ear结构域(erf-associated amphiphilic repression)。
2、水稻基因nat1与高温抗性有关，基因nat1的碱基序列如seq id no.1所示，其编码区序列如seq id no.2所示，其蛋白序列如seq id no.3所示。
3、本专利技术利用crispr-cas9基因编辑技术获得的nat1突变体水稻材料日本晴在高温抗性方面显著增强，包括幼苗期存活率及生殖期农艺性状提高。
4、突变体nat1的抗高温特性，解除对基因bhlh110的抑制作用。
5、基因bhlh110碱基序列如seq id no.4所示，其编码区序列如seq id no.5所示，其蛋白序列如seq id no.6所示。
6、bhlh110突变体高温抗性显著减弱；而bhlh110oe过表达植株高温抗性显著增强。
7、bhlh110促进蜡质合成基因cer1及cer1l表达，增加蜡质厚度，从而正向调控高温抗性。
8、基因cer1碱基序列如seq id no.7所示，其编码区序列如seq id no.8所示，其蛋白序列如seq id no.9所示。
9、基因cer1l碱基序列如seq id no.10所示，其编码区序列如seq id no.11所示，其蛋白序列如seq id no.12所示。
10、本专利技术提供一种利用nat1基因改变水稻高温抗性方面的应用，设计针对nat1基因的sgrna，采用crispr-cas9基因编辑技术，获得突变体植株。
11、nat1基因编辑靶点为gcaaggcgttcgcgtcgtacc，本专利技术提供设计并合成所需引物，经pcr扩增获得完整sgrna，以tkc载体为骨架构建获得转基因载体。引物设计如下：
12、osu6p-f：gtcgtttcccgccttcagtttatgtacagcattacgtagg
13、nat1-u6r:
14、ggtacgacgcgaacgccttgcaacctgagcctcagcgcagc
15、nat1-u6f:
16、gcaaggcgttcgcgtcgtaccgttttagagctagaaatagcaagtta
17、osu6t-r:
18、ctgtcaaacactgatagtttaaacgatggtgcttactgtttag
19、实验步骤如下：第一轮pcr分两管进行，均以带有u6启动子和终止子的载体为模板。pcr1：osu6p-f+nat1-u6r；pcr2：nat1-u6f+osu6t-r。将pcr1和pcr2的产物进行胶回收，随后分别取0.5μl作为模板，使用osu6p-f+osu6t-r作为引物来扩增，两个pcr小片段连接在一起。将回收的pcr产物与已经被pme i酶切完全的tkc载体相连。最后转化大肠杆菌获得阳性转化子后送测序。
20、本专利技术提供含有以上设计的crispr-cas9载体。
21、本专利技术提供含有以上crispr-cas9载体的大肠杆菌和农杆菌。
22、本专利技术提供利用农杆菌将设计的crispr-cas9载体转化到水稻品种日本晴中，筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：(1)构建工程菌：将构建的crispr-cas9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株eha105，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有阳性农杆菌。(2)crispr-cas9载体转化水稻愈伤组织并获得转基因阳性苗苗：用含有crispr-cas9载体的eha105侵染水稻愈伤组织，并于22℃培养室中共培养3天，用羧苄溶液洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养。经过3-4周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗。(3)鉴定靶点是否突变。引物序列为：nat1-ko seq f：gacagacgcaatcgcatgcaaacg,nat1-ko seq r：cagcagcaacgacgacgtctctgtg。pcr产物经测序确认是否突变，并选出其中两种突变类型用于后续实验。其中nat1-ko-1突变为在目标区域插入一个碱基a，nat1-ko-2突变则是插入碱基t，两者均引起移码突变。
23、一种水稻高温抗性基因，水稻基因nat1序列插入碱基a，其碱基序列如seq idno.13所示。水稻基因nat1序列插入碱基a后翻译所得蛋白，其氨基酸序列如seq id no.15所示。
24、一种水稻高温抗性基因，水稻基因nat1序列插入碱基t，其碱基序列如seq idno.14所示。水稻基因nat1序列插入碱基t后翻译所得蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.水稻基因NAT1和bHLH110在提高水稻高温抗性中应用，其特征在于，水稻基因NAT1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，基因bHLH110的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑技术采用CRISPR-Cas9基因编辑技术。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蜡质合成基因CER1如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蜡质合成基因CER1L如SEQ IDNO.10所示。
6.一种水稻高温抗性基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.13所示。
7.一种水稻高温抗性基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
8.一种水稻高温抗性基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.14所示。
9.一种水稻高温抗性基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
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【技术特征摘要】
1.水稻基因nat1和bhlh110在提高水稻高温抗性中应用，其特征在于，水稻基因nat1的碱基序列如seq id no.1所示，基因bhlh110的碱基序列如seq id no.4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑技术采用crispr-cas9基因编辑技术。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的蜡质合成基因cer1如seq id no.7所示。
5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建祥，芦海平，刘学欢，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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