本发明专利技术提供了一种产阿霉素的假单胞工程菌，其是将来源于链霉菌(Streptomyces?peucetius)ATCC?29050的阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的doxA基因前插入来自假单胞菌的Pm启动子，然后将改造后的基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonas?putida)KT2440的基因组中构建得到的。为异源表达及大规模工业化生产阿霉素提供了基础，有着广泛的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种产阿霉素的假单胞工程菌。
技术介绍
阿霉素和道诺霉素为蒽环类抗生素，是临床上常用的抗癌药物。阿霉素又名 14-羟柔红霉素，是道诺菌素结构中道诺糖胺的4'位羟基化衍生物。阿霉素和道诺菌素结构相似，因此作用机制也相同。然而阿霉素与道诺菌素相比，相同剂量的疗效更强，毒副作用更低，且无交叉耐药，抗肿瘤谱比道诺菌素广，使其有更高的应用价值，成为目前临床上应用最广泛的抗肿瘤药物之一。在治疗时阿霉素经常和其它化疗药物例如阿糖胞苷，长春新碱，丝裂霉素C等合并使用以增加疗效。阿霉素生物合成基因簇大小共4131!3bp，其中的doxA基因编码氧化还原酶，负责将道诺菌素进行羟基化得到阿霉素的生物合成步骤。由于DoxA催化作用的不完全性，使含有阿霉素生物合成基因簇的菌株，例如链霉菌Mi^ptomyces peucetius ATCC 29050同时产生阿霉素和道诺菌素。采用S. peucetius ATCC 29050进行阿霉素的生产存在一些不足， 例如菌体生长速度慢(菌体的倍增时间近48小时)、难培养(需严格的富含氧气的环境，且需充分搅拌以使菌体混勻)以及遗传育种较难进行(菌株为革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，诱变剂难以发挥功效)等。这些因素制约着对阿霉素的有效开发和应用。近年来，次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达成为提高化合物产量或有针对性地改造化合物的有效手段。在异源表达宿主的选择中，由于假单胞菌与抗生素主要来源的放线菌密码子的使用相近，有翻译后修饰，安全无毒(如模式菌株恶臭假单胞菌I^eudomonas putida KTM40)，生长快速，次级代谢产物背景清晰等优点，成为首选的宿主菌之一。在其中进行生物合成基因簇的异源表达有着很好的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高产阿霉素的假单胞工程菌。本专利技术的另一目的是提供上述假单胞工程菌在生产阿霉素中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种产阿霉素的假单胞工程菌，其是将阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的doxA基因前插入来自假单胞菌的Rii启动子，然后将改造后的基因簇整合至恶臭假单胞菌O^eudomonas putida)KT2440的基因组中而获得。前述的工程菌，其中所述阿霉素生物合成基因簇来源于链霉菌(Sti^ptomyces peucetius)ATCC 29050。前述的工程菌，改造后的基因簇是与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) KT2440 的基因组中的。前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。其中，trpE基因和trpC基因分别编码邻氨基苯甲酸合酶组分I和吲哚-3-甘油-磷酸合成酶，在trpE基因和trpC基因之间为trpE和trpC之间为PP_0418、PP_0419、 trpG和trpD基因，它们分别编码脂酶，编码32个氨基酸的未知多肽，邻氨基苯甲酸合成酶组分II和邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶。这些基因参与邻氨基苯甲酸的生物合成，均为非必须基因，即去除它们不影响菌株的生理和生化功能。前述的工程菌，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。前述的工程菌，其是将改造的阿霉素生物合成基因簇与卡那霉素抗性基因一起整合至恶臭假单胞菌KTM40基因组中trpE基因和trpC之间的区域而获得。前述的工程菌，其为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) Sino-HDR，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏号CGMCC N0.4638，保藏日期2011年3月7日。该工程菌的培养方法为将所述工程菌接种于LB培养基中，在30°C下进行培养。本专利技术还提供上述工程菌在生产阿霉素中的应用，其是将所述的工程菌进行发酵培养，然后从发酵液中分离纯化得到目标产物阿霉素。本专利技术通过基因工程的方法，将来源于链霉菌(Sti^ptomycespeucetius)ATCC 29050的阿霉素生物合成基因簇中dnrH、dnrX和dnrU基因删除并在编码氧化还原酶的 doxA基因前插入来自假单胞菌的Rii启动子，然后将改造后的基因簇与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌O^seudomonas putida)KT2440的基因组中构建得到高产阿霉素的假单胞工程菌。其中，对恶臭假单胞菌Sino-HDR进行发酵，发酵产物经高效液相色谱(HPLC) 检测表明阿霉素产量为3. 51 μ g/ml，道诺菌素产量为0. 85μ g/ml。而未进行dnrH，dnrX 和dnrU基因删除以及doxA高表达的恶臭假单胞菌Sino-DNDR (保藏号CGMCC N0. 4637)发酵得到的阿霉素和道诺菌素的产量分别为2. 34 μ g/ml和3. 01 μ g/ml。可见在恶臭假单胞菌Sino-HDR菌株中，阿霉素的产量显著提高。所得菌株还可通过优化发酵条件及目标化合物的分离和纯化步骤等进一步地提高阿霉素的产量，达到大规模工业化生产的目的，因此本专利技术有着广泛的应用价值。附图说明图1为本专利技术改造后的阿霉素生物合成基因簇整合至P. putidaKT2440基因组中的示意图，其中doXE-dnrM表示被doxE基因片段所取代的dnrM基因片段，Δ dnrH, Δ dnrX 和Δ dnrU表示dnrH、dnrX和dnrU这三个基因的敲除，xylS-Pm-doxA表示doxA基因置于 Rii启动子的作用之下，xylS是调节Rii启动子表达的调控基因，bla是氨苄青霉素抗性基因， sacB是6-果糖基转移酶基因，oriT是结合转移片段，trpE是分别编码邻氨基苯甲酸合酶组分I基因，kan是卡那霉素抗性基因，trpC是吲哚-3-甘油-磷酸合成酶基因，gph是磷酸乙醇磷酸酶基因，PP_0418是编码脂酶的基因，PP.0419是未知多肽的基因，trpG是邻氨基苯甲酸合成酶组分II基因，trpD是邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶基因，PP_0423是未知功能的基因，DE1、DE2、DE3和DE4为验证P. putidaSino_HDR基因型所设计的PCR引物。图2为本专利技术P. putida Sino-HDR菌株基因型分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中 M代表DL2000DNAMarker, 1为DEl和DE2引物扩增的1. 2kb，2为DE3和DE4引物扩增的 1. ^ib。图3为本专利技术P. putida Sino-HDR菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析结果，其中A是道诺菌素和阿霉素标准品，B是P. putidaSino DNDR菌株的发酵产物，C是 P. putida Sino-HDR菌株的发酵产物。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分的，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．产阿霉素的假单胞工程菌，其特征在于，其是将阿霉素生物合成基因簇中ｄｎｒＨ、ｄｎｒＸ和ｄｎｒＵ基因删除并在编码氧化还原酶的ｄｏｘＡ基因前插入来自假单胞菌的Ｐｍ启动子，然后将改造后的基因簇整合至恶臭假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０的基因组中而获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖志勇，杨小芳，
申请(专利权)人：北京赛诺百奥生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11
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