通过适当涂布最初用有机官能团衍生的基底表面来制造有最小蛋白质背景结合的微阵列的方法。施加的蛋白质抗性聚合涂层具有通过多官能异氰酸酯部分交联至实质性程度的亲水骨架聚合物。含有捕获剂的三维水凝胶微斑点被添加到表面阵列区域上分离的空间位置以形成微阵列。微斑点被添加到基底或涂层上。聚合涂层优选含有与多官能异氰酸酯交联的异氰酸酯加帽的ＰＥＧ以形成氨基甲酸酯聚合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于分析的微阵列产品，更具体是涉及各种类型蛋白质的微阵列产品。
技术介绍
大约过去十年内，微阵列技术已经发展成广泛用于包括分子生物学、微生物学和其它生物技术在内的各种研究领域的重要工具。迄今，该领域的许多工作聚焦于使用DNA阵列或其它类型的核酸阵列，其中，许多斑点(即微斑点(microspot))被置于通常是玻璃载玻片或其它类型“芯片”的固体表面。美国专利No.5,143,854传授了将蛋白质以阵列形式的离散斑点粘附到玻璃板上并提到可以从蛋白质扩展到形成固定有细胞的微阵列。在玻璃载玻片或其它芯片上形成活细胞微阵列的概念也可见于美国专利No.6,548,263(2003/4/15)，该专利传授了使用首先用氨基硅烷处理以形成具有反应性氨基的亲水表面的玻璃薄片(wafer)等，这一概念现在是本领域熟知的。已经开始开发用于蛋白质分析的更加专门的阵列，该阵列同时关注粘附和展示作为微阵列一部分的蛋白质和用DNA阵列分析DNA/蛋白质相互作用。除了在这种蛋白质微阵列中简单使用平板基底外，还开发了使用水凝胶等的三维(3D)微斑点以便更好地结合和呈递作为这种微阵列一部分的蛋白质。公开的国际申请WO02/059372(2002/08/01)显示了一种生物芯片，该芯片具有多个微斑点，所述微斑点附于芯片上表面，为光学透明水凝胶单元形式。这些聚合水凝胶微斑点可用来结合相互作用的蛋白质，或者可结合随后将与加入溶液中的蛋白质或肽反应和/或结合的捕获剂或探针。例如，可将抗原结合到表面以便结合抗体，或者反之亦然。蛋白质、碳水化合物、细胞溶解产物等与微阵列(其表面带有含蛋白质捕获剂等的微斑点)所用玻璃或其它基底的背景结合造成问题已经多年了。当对微阵列成像或通过其它方式阅读微斑点上生成的信号时，蛋白质与微阵列基底的非特异性结合增加了背景噪声。由于这种背景噪声会干扰和防止获得精确读数，因此难以检测和区分从应特异性结合特定斑点的标记获得的信号，尤其是当信号相对较弱时。迄今，用来减轻或缓解该问题的众多常用方法中的两种涉及封闭多个微斑点各自周围基底表面的区域的方式。一种封闭方法是化学涂布基底表面，例如，通过与氨基发生化学反应，玻璃表面籍此通常通过与琥珀酸酐反应而被衍生。第二种方法是使小分子粘附到玻璃表面，例如，BSA、tRNA、脱脂乳固体、酪蛋白等。多种这些封闭方法描述于美国专利公开No.2003/0044823，该文献提议，使用“扩散增强剂溶液”估计对采用核酸探针的测定有效。为防止蛋白质与3D微斑点周围区域表面非特异性结合从而降低背景信号，上述国际出版物提议，使用在将共价结合到氨基的一端具有反应性部分(如异氰酸酯)的单官能聚乙二醇(mPEG)聚合物来涂布未被水凝胶微斑点占据的这种芯片的表面区域或者平板内的孔。美国专利No.5，672,662(Shearwater Polymers)提到用于此用途的PEG-SPA可用于制造涂布的基底，以用于涉及蛋白质的测定。该专利报道，通过使5％(w/v)的甲氧基-PEG-SPA(MW 5000)溶液在0.05M碳酸氢钠(pH8.3)中于40℃反应4小时来将其移植到氨基功能化的玻璃载玻片上。如此固定PEG之后用甲苯冲洗表面，真空干燥并用水冲洗。据报道，随后用血纤蛋白原进行的吸附研究显示，吸附到PEG涂布表面的血纤蛋白原大大减少。Shearwater Polymers，Inc.的美国专利No.5,932,462公开了多种此类单官能PEG(包括分支的单官能PEG)的制造方法，并指出它们可通过避免蛋白质吸附而防止表面污染，从而产生了可用于与血液有关的操作的生物材料。在‘263专利中进行了微图式(micropatterning)反应，其中，光不稳定性保护基或者可通过化学方法除去的保护基首先被施加到表面。微图式之后，加入疏水物质如脂肪酸，使其与未保护的氨基反应，并使这些表面区域不与细胞和蛋白质反应。随后通过除去保护材料和施加细胞粘附材料来活化图式中需要粘附微斑点的位置。或者，据教导可将双官能分子施加在含有反应性羟基的整个表面；然后用机械模板来掩蔽随后需要粘附细胞的区域，同时施加甲苯基氯(tresyl chloride)活化的聚乙二醇(PEG)，使其与作为细胞排斥部分的剩余区域内的双官能分子反应。在这些专利中提到，各种标记可用于这种测定技术以提供需要阅读或成像的信号，所述信号如荧光发射、光密度或放射性。荧光成像技术由于发展最快而最常见，现在的许多发展涉及改进平板上或多孔板上的这种微阵列的荧光测量。已知当制造要和荧光标记一起使用的微阵列时，为增强粘附到微斑点所携带探针上的标记配体的荧光信号，使用镜像基底是有利的。如美国公开申请No.2003/001310(2003/01/16)所述，可用反光金属(例如铝)层涂布玻璃载玻片等，然后再用绝缘材料(如二氧化硅或氧化铝)层涂布，然后再用有机表面层如氨基修饰的硅烷使该层官能化。其中提到，可通过商业途径获得这种涂布的玻璃载玻片以用于制造微阵列以形成阵列，并提到可用适配器(adapter)(如蛋白质结合剂，例如抗生物素蛋白、A蛋白和双官能化学接头)来粘附捕获剂。还教导，在将阵列元件点到基底上之后，其剩余的未涂布表面应用显示出亲水末端的分子封闭以防止随后的非特异性结合。公开了各种封闭剂，其中包括半胱氨酸和BSA以及聚合封闭剂，如在至少一个末端被修饰以结合衍生的基底表面的PEG类似物，例如分子量约为3400-5000的二硫酚修饰的PEG。提到的其它化学封闭剂是用亲水侧链衍生的N-取代的甘氨酸的寡聚物。尽管这些解决非特异性蛋白质结合的已有努力已经显示出一些希望，但结果不完全令人满意，因此需要考虑解决该问题的其它方法。专利技术概述我们现在发现，将具有多官能亲水骨架的聚合物移植到基底表面从而涂布该表面，并通过连接到多官能异氰酸酯分子使这种聚合物实质性交联，可以产生非常有效的蛋白质抗性微阵列基底表面。与Shearwater Polymers，Inc.出售的并用于消除背景噪音目的的单官能和双官能PEG相比，这种涂层将具有改进的消除背景噪音的性能。在一具体方面，本专利技术提供了一种微阵列，其包括具有(a)经衍生以携带有机官能团的平坦的不可渗透的上表面的基底，(b)在所述表面的阵列区域的离散空间位置上的多个三维(3D)微斑点，所述微斑点含有有机捕获剂或者适合直接或间接连接有机捕获剂，和(c)覆盖微斑点周围阵列区域表面的蛋白质抗性聚合涂层，聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述聚合物经多官能异氰酸酯分子交联至实质性程度，所述多官能涂层通过异氰酸酯连接共价结合所述表面的所述有机官能团，提供游离异氰酸酯基团(being covalently bound to said organic functiaonal groups on saidsurface via isocyanate linking and providing free isocyanate groups)。在另一具体方面，本专利技术提供了一种制造使背景结合最小化的微阵列的方法，该方法包括提供具有用有机官能团衍生的平坦的不可渗透的上表面的基底；施加蛋白质抗性涂层，通过使该蛋白质抗性涂层共价结合到所述有机官能团来覆盖所述表面的至少本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微阵列，其包括： 具有经衍生以携带有机官能团的平坦的不可渗透的上表面的基底， 在所述表面阵列区域离散空间位置上的多个三维（３Ｄ）微斑点，微斑点含有有机捕获剂或者适合直接或间接连接有机捕获剂，和 覆盖微斑点周围阵列区域表面的蛋白质抗性聚合涂层，该聚合涂层是多官能的，含有亲水骨架聚合物，所述聚合物经多官能异氰酸酯分子交联至实质性程度，所述多官能涂层通过异氰酸酯连接共价结合所述表面上的所述有机官能团，提供游离异氰酸酯基团。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P钦伯格，
申请(专利权)人：生物概念股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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