一种大豆抗冻蛋白的制备方法、应用技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种大豆抗冻蛋白的制备方法，包括以下步骤：将含有所述抗冻蛋白表达序列的质粒转化至表达大肠杆菌中，进行蛋白表达；用亲和层析法对蛋白进行纯化；纯化后用凝血酶切除His标签，获得抗冻蛋白；所述抗冻蛋白为PM1蛋白为PM1‑N短肽。本发明专利技术还提供了PM1蛋白或PM1‑N短肽在制备转基因抗冻或抗寒植物方面的应用；PM1蛋白或PM1‑N短肽用于制备生物类制品的冻存保护剂的应用。本发明专利技术提供的PM1蛋白及PM1‑N短肽的制备方法，制备过程简单，便于大批量生产。本发明专利技术还提供了的PM1蛋白或PM1‑N短肽的应用，不仅为PM1蛋白或PM1‑N短肽的应用拓展了新的空间，更加速了PM1蛋白或PM1‑N短肽相关研究的进展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，尤其涉及一种大豆抗冻蛋白的制备方法、应用。
技术介绍
生物在遭受低温胁迫时，造成细胞内环境脱水、形成结晶，继而造成细胞膜结构破裂或蛋白质失活，细胞或细胞器受到破坏，导致生物体受到损伤。因此，生物体要抵御低温冻害、寒害，最重要、最基本的要素有：一、避免细胞内结冰；二、提高细胞膜(结构)及生物大分子的低温稳定性。在低温条件下，有的生物体内会产生具有提高生物抗冻能力的蛋白质，如上世纪60年代在极区的海洋鱼类血清中发现一种可阻止冰晶生长的特异性蛋白质-抗冻蛋白(AFP)。目前发现的抗冻蛋白多为有序蛋白，对被保护对象有一定的选择特性。抗冻蛋白的发现，为在农业低温育种、食品工业、医药行业上的广泛的潜在应用奠定了重要基础。大豆是我国的主要经济作物，科学工作者已从大豆种子中发现了一种新型抗冻蛋白—PM1蛋白，PM1蛋白是LEA蛋白(late embroygenesis abundant protein,LEA)的一种，属于固有无序蛋白，在天然溶液中呈现无结构状态。与有序蛋白相比较，无序蛋白具有对热稳定、高可溶性特性，也具有可与被保护对象无特异性结合的特性。现有的PM1蛋白的提取方法较为繁琐，且提取的PM1蛋白纯度较低；对于PM1蛋白，普遍认可的观点是其具有广泛的应用前景，但对于它的具体用途，目前尚无法确定。
技术实现思路
本专利技术采用一种大豆抗冻蛋白的制备方法、应用，旨在拓展PM1蛋白和PM1-N短肽(PM1的N端短肽)作为抗冻蛋白的具体用途。本专利技术是这样实现的，一种大豆抗冻蛋白的制备方法，包括以下步骤：将含有所述抗冻蛋白表达序列的质粒转化至大肠杆菌中，进行蛋白表达；用亲和层析法对蛋白进行纯化；纯化后用凝血酶切除His标签，获得所述抗冻蛋白；所述抗冻蛋白为PM1蛋白或PM1-N短肽。进一步地，所述亲和层析法中所用层析柱参数如下：填料：Chelating Sepharose Fast Flow 4BTM，流速为3mL/min。本专利技术还提供了PM1蛋白或PM1-N短肽在制备转基因抗冻或抗寒植物方面的应用。本专利技术还提供了PM1蛋白或PM1-N短肽用于制备生物类制品的冻存保护剂的应用。进一步地，所述生物类制品包括蛋白及酶制剂。进一步地，所述生物类制品包括细胞、胚胎、组织或器官。进一步地，所述生物类制品为兔红细胞。进一步地，所述冻存保护剂中还含有甘油。进一步地，所述冻存保护剂中还含有海藻糖。进一步地，所述PM1蛋白或PM1-N短肽为重组蛋白。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的PM1蛋白或PM1-N短肽的制备方法，制备过程简单，获得的蛋白纯度高，便于大规模发酵生产。本专利技术通过研究提供了PM1蛋白和PM1-N短肽的功能，将所述PM1蛋白或PM1-N短肽用于制备转基因抗冻或抗寒植物；将所述PM1蛋白用于制备生物类制品的冻存保护剂，所述生物类制品包括细胞、胚胎、组织或器官，以及蛋白及酶制剂。本专利技术所提供的PM1蛋白或PM1-N短肽的应用，不仅为PM1蛋白的应用拓展了新的空间，为PM1蛋白的应用指明了方向，更加速了PM1蛋白相关研究的进展。附图说明图1是本专利技术实施例提供的PM1蛋白及其短肽PM1-N的序列及电泳图；图2是本专利技术实施例1提供的经冻融处理后的脂质体的浊度检测结果示意图；图3是本专利技术实施例1提供的经冻融处理后的脂质体的粒径测定结果示意图；图4是本专利技术实施例1提供的冻融处理前后的样品的显微镜显示图，其中图4a为未加PM1、PM1-N短肽组，图4b为加PM1蛋白组、图4c为加PM1-N短肽组；图5是本专利技术实施例2提供的PM1蛋白对兔红细胞的保护作用的测定结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。PM1蛋白在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上的氨基酸序列为：MQGGKKAGESIKETATNIGASAKAGMEKTKATVQEKAERMTARDPVQKELATQKKEAKMNQAELDKQAARQHNTAAKQSATTAGHMGHGHHTTGTGTGTATYSTTGEYGQPMGAHQTSAMPGHGTGQPTGHVTEGVVGSHPIGTNRGPGGTATAHNTRAGGKPNDYGYGTGGT(SEQ ID NO:1)，(可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001238562.1网页中获取)。PM1-N短肽是PM1的N端短肽，其氨基酸序列为：MQGGKKAGESIKETATNIGASAKAGMEKTKATVQEKAERMTARDPVQKELATQKKEAKMNQAELDKQAARQHNTAAKQSATTAG(SEQ ID NO:2)。按照本专利技术的技术方案制备PM1蛋白或PM1-N短肽，过程如下：将pET28a/PM1质粒、pET28a/PM1-N质粒转化至大肠杆菌BL21Star中，进行蛋白表达；用亲和层析法对蛋白进行纯化；纯化后，用凝血酶切除His标签，分别获得PM1蛋白、PM1-N短肽。具体地，所述亲和层析法中所用层析柱参数如下：柱长：20cm；直径：16mm，填料：Chelating Sepharose Fast Flow 4BTM，填料体积：10mL；厂家：Amersham Biosciences，流速为3mL/min。所制得的PM1蛋白、PM1-N短肽的电泳图如图1中所示，从图中可以看出PM1蛋白的分子量约为20-22kDa，PM1-N短肽的分子量约为11kDa。PM1蛋白、PM1-N短肽为固有无序蛋白，在天然溶液中它们呈无序结构状态，对被保护对象没有明显的选择性。以下通过具体的实施例对所制得的PM1蛋白、PM1-N短肽的功能进行测试，以探索其应用。实施例1 人工脂质体的制备及PM1蛋白、PM1-N短肽对经冻融处理后脂质体的稳定作用细胞膜的化学成分主要是由磷脂、少量蛋白质和多糖组成。我们选用POPC(油酰磷脂酰胆碱)制备人工脂质体。称取40mg的POPC，用500μl的氯仿将POPC完全溶解，用氮气缓慢除去氯仿后将POPC置于真空环境中1h，随后用1ml的磷酸缓冲液(pH 7.4)重新溶解POPC，溶解的POPC用挤压机反复挤压，使其通过100nm的聚碳酸脂膜形成直径约为100nm的脂质体。制备好的脂质体用磷脂定量试剂盒定量后稀释至20mg/ml，取两组100μl的脂质体分别加入等体积的磷酸缓冲液(未加PM1蛋白的对照组)、0.8mg/ml的PM1蛋白、0.8mg/ml的PM1-N短肽(加PM1蛋白、PM1-N短肽组)。28℃孵育30min后，置于-80℃冻30min，28℃溶解30min，反复3次。(一)经冻融处理后的脂质体的浊度检测：浊度是一种光学效应，可以反映射入光线与溶液中悬浮颗粒的相互作用，表征光线透过水层时受到阻碍的程度。用测量浊度反映样品透射光的量或散射光的量，即溶液的透射光强度越小或散射光强度越大，表征水溶液的浊度越大。取冻融处理前后的样品各20μl用缓冲液稀释至200μl，用紫外分光光度计测定其OD400值，如图2所示。未加PM1蛋白及PM1-N短本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有所述抗冻蛋白表达序列的质粒转化至大肠杆菌中，进行蛋白表达；用亲和层析法对蛋白进行纯化；纯化后用凝血酶切除His标签，获得所述抗冻蛋白；所述抗冻蛋白为PM1蛋白或PM1‑N短肽。

【技术特征摘要】
1.一种大豆抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有所述抗冻蛋白表达序列的质粒转化至大肠杆菌中，进行蛋白表达；用亲和层析法对蛋白进行纯化；纯化后用凝血酶切除His标签，获得所述抗冻蛋白；所述抗冻蛋白为PM1蛋白或PM1-N短肽。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析法中所用层析柱参数如下：填料：Chelating Sepharose Fast Flow 4BTM，流速为3mL/min。3.PM1蛋白或PM1-N短肽在制备转基因抗冻或抗寒植物方面的应用。4.PM1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑易之，刘国宝，陈丽伊，彭显明，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44