一株代谢工程菌及其在利用多种底物生产香兰素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株代谢工程菌的构建方法与应用。本发明专利技术模拟天然香兰素合成途径，将相关基因转入大肠杆菌K12进行基因改造，使其成为具有香兰素合成能力的代谢工程大肠杆菌E-GV。本发明专利技术公开了所述的代谢工程菌在催化多种廉价、易获取碳源包括葡萄糖、木糖、甘油和酪氨酸等生产香兰素中的应用。应用本发明专利技术的代谢工程大肠杆菌可以在48小时内将酪氨酸转化为97.2mg/l香兰素；在72小时内将葡萄糖、木糖和甘油分别转化为19.3mg/l，13.3mg/l和24.7mg/l香兰素。本发明专利技术中构建的代谢工程菌株具有转化底物廉价，可以利用酪氨酸、葡萄糖、甘油和木糖等廉价碳源为底物，降低了生产成本，操作简便，菌株传代稳定。具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用分子生物学技术，通过模拟天然香兰素合成途径来构建的一株大肠杆菌(以下简称代谢工程菌或者代谢工程大肠杆菌)，及应用此代谢工程菌转化多种廉价的底物酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖生产香兰素的方法，属于生物

技术介绍
香兰素(Vanillin,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，又名香草醛，香荚兰素。香兰素主要存在于天然植物香荚兰中，香荚兰的豆荚中大约有2％干重的香兰素。香兰素被誉为“香料皇后”，是世界上产量最大，应用最为广泛的香料之一。香兰素具有独特香气，在食品、饮料、香精香料及医药领域中占据极为重要的地位。在化学工业中，香兰素还被用作镀锌槽的增白剂和锌电镀的活性剂，香兰素也是生产多巴和罂粟碱的基础原料。目前，全球对香兰素的年需求量已经超过了16,000吨。植物提取法和化学合成法是香兰素生产最为常用的两种方法。化学合成法是利用丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等作为合成底物，其低廉的成本和简单的工艺使得这种方法生产的香兰素占据了绝大部分的市场(约90％)。然而，化学合成法会造成严重的环境污染，并且合成香兰素在纯度、香气和安全性等方面都远不及天然提取的香兰素，使得其价格远远低于天然香兰素。植物提取法是从香荚兰的豆荚中提取，种植区域的限制、气候的影响、高强度的体力劳动和较低的产率使得天然香兰素的产量远低于市场需求，导致天然香兰素价格及其昂贵，达到合成香兰素的300倍(高达4,000美元/公斤)。美国FDA规定，植物或动物原料通过物理、酶法或微生物转化得到的产品被认为是天然的产品。因此，温和的反应条件、简单的提取步骤、快速高效生产过程和清洁无污染等优势使得生物合成法(微生物转化法)成为最具潜力的天然香兰素合成方法。目前，已经报道了链霉菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌和肠杆菌等微生物可以转化底物生成香兰素，这些底物包括了阿魏酸、丁香酚、木质素、异丁香酚和香兰酸等。1999年,Muheim和Lerch利用西唐链霉菌转化阿魏酸得到6.4g/L香兰素。2000年Rabenhorst等利用拟无枝菌酸转化阿魏酸,获得11.5g/L的香兰素。2007年,华栋梁等利用链霉菌转化阿魏酸,借助吸附树脂的作用,获得19.2g/L的香兰素。虽然利用阿魏酸等化合物作为底物，通过微生物发酵制备香兰素的技术已经得到广泛的研究和应用，但这些化合物较为昂贵，占据了生产成本的绝大部分。因此，寻求更为廉价的底物成为香兰素生物法制备的一个重要研究方向。葡萄糖可由淀粉水解得到，价格低廉，原料充足。1998年Li等人利用基因重组的大肠杆菌将葡萄糖通过磷酸戊糖途径和莽草酸途径转化为香草酸，之后，香草酸在胞外经过粗糙脉孢菌中的芳醛脱氢酶还原，生成微量的香兰素。2009年Hansen等对两种常见的酵母菌株(粟酒裂殖酵母和酿酒酵母)进行代谢工程改造,分别向两个菌株中引入3个和4个不同来源的外源基因,同时对原始菌株中降解香兰素的基因进行敲除,改造后的菌株以葡萄糖为初始底物,可以获得65mg/L和45mg/L香兰素。显而易见，这种生物转化策略底
物经济，代谢途径简单可控，很有实现工业化生产的可能。但是，Li等人的合成策略需要胞外纯酶的催化和添加昂贵的辅因子，步骤繁琐，并且产量较低，使得生产效率不高；Hansen等人的合成策略在酵母中进行，而酵母具有较强香兰素代谢能力，尽管敲除了香兰素代谢的相关基因，但醇脱氢酶依然导致了副反应的发生，使得产量降低和副产物的生成。此外，这两种方法都以脱氢莽草酸为前体，在一定层度上破坏了菌株自身的芳香氨基酸合成途径。植物中香兰素天然合成途径是以初级代谢产物酪氨酸为前体的，经过苯丙烷途径可以形成香兰素，微生物中并不存在这一合成途径。这条途径可以延伸微生物的芳香氨基酸合成途径，为香兰素的生物合成提供了一种新思路，然而对于这条合成途径的模拟以及在微生物中的重构还未见报道。此外，利用除葡萄糖以外的廉价碳源，如木糖和甘油来生产香兰素的研究也未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于构建一株转化底物廉价、操作简便、遗传稳定的，用于香兰素生产的代谢工程大肠杆菌。本专利技术所述的应用方法以廉价易获取碳源(如甘油、葡萄糖、木糖等)为底物，降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。本专利技术的技术方案如下：首先本专利技术提供了构建含有酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因元件的代谢工程大肠杆菌的方法。所述酪氨酸解氨酶基因能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交，并且编码具有酪氨酸解氨酶活性的蛋白质，优选地，其中所述酪氨酸解氨酶来源于西班牙糖丝菌。所述对香豆酸羟化酶基因能够与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，并且编码具有对香豆酸羟化酶活性的蛋白质，优选地，其中所述对香豆酸羟化酶来源于西班牙糖丝菌。所述咖啡酸甲基转移酶基因能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有咖啡酸甲基转移酶活性的蛋白质，优选地，其中所述咖啡酸甲基转移酶来源于拟南芥。所述阿魏酰辅酶A合酶基因能够与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交，并且编码具有阿魏酰辅酶A合酶活性的蛋白质，优选地，其中所述阿魏酰辅酶A合酶来源于链霉菌V-1。所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因能够与SEQ ID NO.5的核苷酸序列杂交，并且编码具有烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶活性的蛋白质，优选地，其中所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶来源于链霉菌V-1。代谢工程大肠杆菌E-GV的构建方法，包括以下步骤：(1)利用PCR技术，以西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis DSM 44229)基因组为模板，扩增得到命名为sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名为sam5的对香豆酸羟化酶基因(基因序列见序列表)；(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NcoI和EcoRI；(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒用连接酶进行连接，构建
重组质粒pACYCDuet-sam8；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；(4)利用内切酶分别对步骤(1)和(3)中得到的sam5基因片段和pACYCDuet-sam8质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NdeI和XhoI；(5)将步骤(4)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-sam8质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；(6)根据大肠杆菌的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的咖啡酸甲基转移酶基因(comt)进行密码子优化，并在前端加上T7启动子序列(基因序列见序列表)，用重组PCR的方法进行合成，并纯化；(7)利用内切酶分别对步骤(5)中得到的重组质粒和步骤(6)中得到的基因片段进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为SacI和NotI；(8)将步骤(7)中双酶切后的基因片段和质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；(9)利用PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种代谢工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所用基因元件为酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种代谢工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所用基因元件为酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因。2.根据权利要求1所述的代谢工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，其所述酪氨酸解氨酶基因与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交，并且编码具有酪氨酸解氨酶活性的蛋白质，其中所述酪氨酸解氨酶来源于西班牙糖丝菌；所述对香豆酸羟化酶基因与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，并且编码具有对香豆酸羟化酶活性的蛋白质，其中所述对香豆酸羟化酶来源于西班牙糖丝菌；所述咖啡酸甲基转移酶基因与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有咖啡酸甲基转移酶活性的蛋白质，其中所述咖啡酸甲基转移酶来源于拟南芥；所述阿魏酰辅酶A合酶基因与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交，并且编码具有阿魏酰辅酶A合酶活性的蛋白质，其中所述阿魏酰辅酶A合酶来源于链霉菌V-1；所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因与SEQ ID NO.5的核苷酸序列杂交，并且编码具有烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶活性的蛋白质，其中所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶来源于链霉菌V-1。3.根据权利要求2所述的代谢工程大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用PCR技术，以西班牙糖丝菌Saccharothrix espanaensis DSM 44229基因组为模板，扩增得到命名为sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名为sam5的对香豆酸羟化酶基因；(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切；(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8；(4)利用内切酶分别对步骤(1)和(3)中得到的sam5基因片段和pACYCDuet-sam8质粒进行双酶切；(5)将步骤(4)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-sam8质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5；(6)根据大肠杆菌的密码子偏好性将拟南芥Arabidopsis thaliana中命名为comt的咖啡酸甲基转移酶基因进行密码子优化，并在前端加上T7启动子序列，用重组PCR的方法进行合成，并纯化；(7)利用内切酶分别对步骤(5)中得到的重组质粒和步骤(6)中得到的基因片段进行双酶切；(8)将步骤(7)中双酶切后的基因片段和质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt；(9)利用PCR技术，以链霉菌Streptomyces sp.V-1保藏号为CCTCC M 206065基因组为模板，扩增得到命名为fcs的阿魏酰辅酶A合酶基因和命名为ech的烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因；(10)利用内切酶分别对步骤(9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切；(11)将步骤(10)中双酶切后的基因片段和pETDuet-1质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，倪俊，陶飞，张兆斌，
申请(专利权)人：爱普香料集团股份有限公司，上海爱普植物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31