The invention discloses a method for delivery of foreign DNA into Mucor ungerminated spores, including Mucor culture and spore collection, Mucor spore pretreatment and the use of HDEN method of shock Mucor spores of three steps to get into the Mucor spore plasmid transformation. The invention uses ungerminated spores as the starting materials of exogenous molecules, and the application of HDEN electricity transformation technology to exogenous DNA Mucor resting spores, spore germination can save do the complicated procedure, preparation of protoplasts or Agrobacterium transformation steps to eliminate the traditional method, and high conversion rate of reaction each transformation system, at least not less than 6000 transformants effect.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,具体涉及一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法。
技术介绍
总状毛霉,属于毛霉目,毛霉科,可以生产蛋白酶、羟基黄体酮、壳聚糖等各种具有经济价值的产物,是一种重要的工业发酵菌种。但是目前对总状毛霉转化外源DNA非常困难,制约了其基因工程改造。基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因按预先设计的蓝图,在体外构建DNA分子,然后导入细胞,以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品(比如将某个具有重要经济价值的酶基因,导入到总状毛霉细胞内,做酶蛋白高表达,生产该酶)。这一领域中,很重要的一个环节,就是把外来的DNA,导入到细胞内部。针对不同物种和不同状态的细胞,需要不同的导入方法,才可以让外来的DNA跨过细胞壁和细胞膜,运送到细胞内部。目前用于丝状真菌领域(包括总状毛霉)的主要DNA转化方法包括:1.原生质体介导转化(protoplast-mediated transformation):该方法使用各种酶水解真菌菌丝体的细胞壁,暴露出细胞膜,在一定的化学条件下,细胞膜可以吸收外源DNA。但是由于真菌细胞壁的结构和成分复杂,而且不同物种、甚至同一物种的不同亚种的细胞壁结构和成分都不一样,因此,无法统一原生质体制备的方法,而且,很多真菌,尤其是总状毛霉,原生质体制备非常困难,步骤极其繁琐,而且需要特殊的、昂贵的细胞壁水解酶。2.根瘤农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation):根瘤农杆菌(Agrobacteriu ...
【技术保护点】
一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:1)总状毛霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种总状毛霉,培养至培养基表面长满总状毛霉孢子,洗下培养基表面的总状毛霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;2)总状毛霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3‑4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104‑1011个/ml的总状毛霉孢子悬液;所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0‑9.5;3)使用HDEN法电击总状毛霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的总状毛霉孢子悬液以及待转化质粒,混匀,得到孢子与质粒混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min,然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部,通电,使得孢子与质粒混合物内部产生电场,电击之后再将 ...
【技术特征摘要】
1.一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:1)总状毛霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种总状毛霉,培养至培养基表面长满总状毛霉孢子,洗下培养基表面的总状毛霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;2)总状毛霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3-4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104-1011个/ml的总状毛霉孢子悬液;所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0-9.5;3)使用HDEN法电击总状毛霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的总状毛霉孢子悬液以及待转化质粒,混匀,得到孢子与质粒混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部,通电,使得孢子与质粒混合物内部产生电场,电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后将孢子和质粒混合物吸出,得到导入外源DNA的休眠的总状毛霉孢子;所述总状毛霉悬液与待转化质粒的比例为:6-600000μl的总状毛霉孢子悬液:0.1-10000μg的待转化质粒;所述电击参数如下:电压1-6000V,脉宽2-2000000ms,重复1-100次,每次间隔5-50000ms。2.根据权利要求1所述的一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法,其特征在于:所述步骤1)的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。3.根据权利要求1所述的一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法,其特征在于:所述步...
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