抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用。所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞(细胞模型Ⅰ)、包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞(细胞模型Ⅱ)。细胞模型的构建方法包括HPV环状DNA的制备、质控检测、游离HPV扩增检测和拷贝数的绝对定量检测。所述应用为通过检测药物施用后对模型细胞的直接抗增殖作用以及对HPV基因组DNA复制的抑制作用，筛选具有抗1型和11型人乳头瘤病毒活性的药物。该细胞模型所组成的体系可用于筛选人乳头瘤病毒(HPV)皮肤低危型(1型)及粘膜低危型(11型)的治疗药物，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用
本专利技术涉及细胞生物学和抗病毒领域，具体地说，涉及一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用。
技术介绍
低危型HPV感染在临床上可分为典型病损、无明显皮损的亚临床感染(SPI，SubclinicalHPVinfection)和潜伏感染(LPI，LatentHPVinfection)，其中SPI是HPV感染的主要临床表现形式。SPI是指肉眼观察无异常，醋酸白试验阳性，组织病理有鳞状上皮非典型性增生，见挖空细胞或可疑挖空细胞，同时HPVDNA检测呈阳性(病毒DNA以低拷贝状态存在于基底细胞层中)的一种临床HPV感染阶段，可持续存在或进一步发展为典型疣，也是增殖疣治疗后复发的主要原因之一，消除SPI能有效降低复发率。临床常见的增殖性疣包括寻常疣、趾疣、扁平疣和尖锐湿疣，其中Ⅰ型HPV病毒(HPV1)按照感染部位及危害程度分类属于皮肤低危型，是引起寻常疣、趾疣、扁平疣的主要亚型之一，而11型HPV病毒(HPV11)感染部位为粘膜细胞，属于粘膜低危型，是引起生殖器疣的主要亚型之一。以寻常疣为代表的增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV1模型细胞；或者所述药物筛选模型为包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV11模型细胞。/n

【技术特征摘要】
1.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV1模型细胞；或者所述药物筛选模型为包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV11模型细胞。


2.根据权利要求1所述的药物筛选模型，其特征在于，所述报告基因为抗生素抗性基因，优选新霉素抗性基因。


3.根据权利要求2所述的药物筛选模型，其特征在于，携带报告基因的质粒为pRP-Neo；其中，质粒pRP-Neo是以pRP为出发载体，通过Gateway技术用新霉素抗性基因替换出发载体上的ccdB-cmR序列得到的；
优选地，HPV1环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1；HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。


4.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型的构建方法，其特征在于，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞，经G418筛选得到存活的阳性细胞克隆，传代后作为抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，分别命名为HPV1模型细胞、HPV11模型细胞；
其中，质粒pRP-Neo的定义同权利要求3中所述。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在六孔板中培养HaCaT细胞，待细胞密度达8×105-10×105个/孔，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞；
(2)转染24h后，更换新鲜完全培养基继续培养24h，转染细胞经消化按1：10稀释后采用终浓度为450-550μg/mL的G418进行筛选，10-16天后，更换为不含G418的完全培养基进行细胞培养，存活的阳性细胞克隆进行传代培养；
其中，所述完全培养基为90％DMEM高糖培养基+10％FBS；
优选地，步骤(1)中HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，HPV1环状DNA、HPV11环状DNA的构建方法如下：
1)人工合成HPV1全基因组DNA，通过BamHⅠ位点克隆入pGS1载体，得到质粒pGS1-HPV1，将质粒pGS1-HPV1、pBR322-HPV11分别用BamHⅠ酶切，胶回收7.82Kb或7.93Kb条带；将胶回收线性化HPV1或HPV11采用T4连接酶进行片段自连，分别得到连接产物HPV1环状DNA、HPV11环状DNA；
2)将步骤1)所得连接产物浓缩纯化后进行酶切鉴定；
步骤1)中，酶切体系为：pGS1-HPV1、pBR322-HPV11质粒DNA2-5μg，BamHⅠ1μL，10×Cutsmartbuffer5μL，ddH2O补齐至50μL；酶切条件：37℃水浴酶切1h；
步骤1)中，连接体系为：线性化HPV1或HPV11终浓度5-10ng/μL，10×连接酶缓冲液30μL，T4连接酶终浓度0.02-0.1WeissUnit/μL，ddH2O补齐至300μL；连接条件为：15-18℃水浴连接15-20h；
步骤2)中，HPV1环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV1环状DNA30-100ng，KpnⅠ1μL，10×Mbuffer2μL，ddH2O补齐至...

【专利技术属性】
技术研发人员：王召静，刘金毅，林福玉，孙纪慧，程永庆，
申请(专利权)人：北京三元基因药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11