用于制造细胞外基质的方法和组合物技术

本文的实施方案包括用于制造细胞外基质(ECM)的方法、试剂盒和组合物。在一些实施方案中，所述方法包括将成纤维细胞分化为诱导型多能干细胞，扩增所述诱导型多能干细胞，并将所述诱导型多能干细胞分化为成纤维细胞。所述成纤维细胞可产生成熟ECM，所述成熟ECM可被分离并用于医疗和/或美容产品和程序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制造细胞外基质的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请在PCT规则4.10下要求于2017年7月28日提交的标题为“用于制造细胞外基质的方法和组合物”的美国国家申请号15/662901的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。序列表、表格或计算机程序表的引用电子版序列表连同本申请一起提交。序列表以文件名为“SEQUENCEBREK001WO.TXT”的文件被提交，其于2018年6月22日被创建并最后修改，其大小为247,550字节。电子版序列表中的信息以引用方式整体并入本文。
技术介绍
细胞外基质(ECM)是具有许多美容和治疗用途的多功能生物材料。大多数结缔组织包含胶原蛋白，并且在较小程度上(基于相对重量丰度)包含其他糖蛋白(例如层粘连蛋白、纤连蛋白)和糖胺聚糖(GAG)，所述糖胺聚糖包括透明质酸和其它硫酸化的GAGs(例如聚集蛋白聚糖和基底膜蛋白聚糖)。然而，胶原蛋白是交联的，并且需要酶促或化学降解以分离用于美容或治疗用途,并制成供人类使用的有用产品。包括使用胃蛋白酶消化或化学修饰之后牛和猪的真皮、猪肠粘膜下层和人尸体来源的组织(例如皮肤和骨)的实例在本领域中都是众所周知的。ECM的动物来源(例如猪和牛组织)具有不希望的免疫反应的风险，包括已知的对牛和猪抗原或过敏原(主要是蛋白质)的过敏，而使用动物来源的组分(最常见的包括牛血清、牛白蛋白或猪胰蛋白酶)或非人的植物来源的蛋白质(包括大豆胰蛋白酶抑制剂或在植物中产生的重组人白蛋白，其可含有残留的植物蛋白质或多肽)的人细胞具有相同的风险。因此，来自动物来源的ECM的商业用途可能会受到安全性问题和/或监管障碍(为了验证动物组分去除至商业使用许可所需的更安全的残留水平)的限制。人类免疫系统足够敏感以与极低丰度的抗原反应，并且已经证明动物和植物蛋白质会引起不希望的免疫反应，包括潜在的威胁生命的过敏反应，其在某些情况下会引起过敏性休克甚至死亡。动物源性和植物源性蛋白质组分，以及在动物源性或植物源性蛋白质组分中生长的人类细胞统称为“异种的(xenogeneic)”。另一方面，不接触这些动物源性和植物源性蛋白质组分而被制造的产品被称为“无异种(xeno-free)”。在异种培养基中生产ECM的常规方法可能需要去除动物源性和/或植物源性蛋白质组分，这限制了这些方法的商业用途。人ECM可以从尸体的同种异体组织中获得。然而，这种尸体来源的ECM存在疾病传播的风险，并且商业可扩展性有限，因为每个供体提供的可获得的人ECM数量有限(例如，一个70kg的人含有少于20重量％的人胶原或不多于几千克的人原始ECM材料)。另外，尸体来源的组织涉及昂贵的安全性测试以降低疾病传播的一些风险，并且必须对每个尸体供体进行大量致病病原体(包括病毒和细菌)的广泛测试。另外，ECM可用于动物饲料。然而，作为实际问题，使用细胞培养或从尸体收获来生产ECM的常规方法在商业规模上会是成本高昂的。根据本文的一些实施方案，描述的是用于以商业规模有效生产ECM同时使疾病传播和免疫原性的风险最小化的方法、组合物和试剂盒。
本文的一些实施方案涉及用于制造细胞外基质(ECM)的方法和组合物。在一些实施方案中，描述了细胞培养的方法和组合物
技术实现思路
一些实施方案包括制造细胞外基质的方法。所述方法可包括将诱导型多能干细胞(iPSC)分化为生产成纤维细胞。所述方法可包括培养所述生产成纤维细胞，并且通过培养，所述生产成纤维细胞可产生细胞外基质(ECM)。所述方法可包括将ECM与所述生产成纤维细胞分离，从而制造ECM。在一些实施方案中，所述方法还包括在将iPSC分化为生产成纤维细胞之前对前体成纤维细胞进行去分化以形成iPSC。在一些实施方案中，所述方法还包括在所述分化之前扩增iPSC，例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30倍(包括所列值的任意两个之间的范围)。在一些实施方案中，所述方法还包括在所述分化之前构建所述iPSC的储库。在一些实施方案中，仅有的被分化的iPSCS来自单一供体。在一些实施方案中，所述生产成纤维细胞的培养在常氧下进行。在一些实施方案中，培养所述生产成纤维细胞不包括培养间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，所述前体成纤维细胞包括成人真皮(活检)成纤维细胞。在一些实施方案中，分离ECM包括纯化ECM，从而制造至少约80％w/wECM的组合物。在一些实施方案中，纯化ECM包括在酸性缓冲液中洗涤ECM，并使包含所述生产成纤维细胞和ECM的溶液与葡聚糖酶接触。在一些实施方案中，分离ECM包括将ECM与基底或固相分离。在一些实施方案中，分离的ECM与任何基底或固相是分开的(例如，不结合)。在一些实施方案中，分离的ECM尚未被任何蛋白酶消化，因此是完整的。在一些实施方案中，ECM包含胶原蛋白。在一些实施方案中，约90％(w/w)的ECM是COL1，并且约10％的ECM选自由以下组成的组：COL3、COL4、COL5、COL6，以及这些中的任意项的组合。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述前体成纤维细胞与去分化因子接触，从而将所述前体成纤维细胞去分化成所述iPSC。在一些实施方案中，iPSC不含编码Oct家族成员、Sox家族成员、Klf家族成员的病毒插入物。在一些实施方案中，iPSC是无足迹的。在一些实施方案中，所述方法不包括以下任何一种：胚胎干(ES)细胞、骨髓专能(multipotent)干细胞、ES衍生的MSC或非专能新生儿包皮成纤维细胞系。在一些实施方案中，ECM包含COL1的C-末端前肽，或三螺旋或非还原的γ型纤维状胶原，或两者。在一些实施方案中，ECM包括三螺旋和/或非还原的γ型纤维状胶原。在一些实施方案中，所述方法还包括使生产成纤维细胞与血清接触，直到生产成纤维细胞产生成熟的胶原蛋白，然后逐渐减少血清量，直到血清浓度降低至少95％。在一些实施方案中，所述逐渐减少在至少约5天的时间内。一些实施方案包括用于制造ECM的试剂盒。所述试剂盒可包含组合物，所述组合物包含人成纤维细胞。所述试剂盒可包含去分化因子。所述试剂盒可包含成纤维细胞分化因子。在一些实施方案中，组合物的所有成纤维细胞来自单一供体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含基底，例如葡聚糖微载体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含葡聚糖酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含葡聚糖酶和DNA酶。一些实施方案包括包含至少80％(w/w)细胞外基质的组合物，其中所述细胞外基质根据以上方法中的任一种来制造。一些实施方案包括包含iPSC衍生的成纤维细胞的细胞培养物，其中所述iPSC衍生的成纤维细胞产生成熟的细胞外基质。所述细胞培养物还可包括去分化因子。在一些实施方案中，至少50％的组合物(w/w)包含ECM。一些实施方案包括制造细胞外基质(ECM)的方法。所述方法可包括在基底上培养成纤维细胞和/或间充质干细胞(MSC)。所述基底可包括至少两个表面。培养可以是无血清的和无异种的。可以进行培养，直到成纤维细胞和/或MSC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造细胞外基质的方法，所述方法包括：/n将诱导型多能干细胞(iPSC)分化为生产成纤维细胞；/n培养所述生产成纤维细胞，借此所述生产成纤维细胞产生细胞外基质(ECM)；和/n将所述ECM与所述生产成纤维细胞分离，从而制造所述ECM。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170728 US 15/662,9011.一种制造细胞外基质的方法，所述方法包括：
将诱导型多能干细胞(iPSC)分化为生产成纤维细胞；
培养所述生产成纤维细胞，借此所述生产成纤维细胞产生细胞外基质(ECM)；和
将所述ECM与所述生产成纤维细胞分离，从而制造所述ECM。


2.如权利要求1所述的方法，其还包括在将所述iPSC分化为所述生产成纤维细胞之前对前体成纤维细胞进行去分化以形成所述iPSC。


3.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述分化之前扩增所述iPSC。


4.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述分化之前构建所述iPSC的储库。


5.如权利要求1所述的方法，其中，仅有的被分化的iPSC来自单一供体。


6.如权利要求1所述的方法，其中，所述生产成纤维细胞的培养在常氧下进行。


7.如权利要求1所述的方法，其中，培养所述生产成纤维细胞不包括培养间充质干细胞(MSC)。


8.如权利要求1所述的方法，其中，所述iPSC是无足迹的。


9.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法不包括如下任何一种：胚胎干(ES)细胞、骨髓专能干细胞、ES衍生的MSC或非专能新生儿包皮成纤维细胞系。


10.如权利要求1所述的方法，其中，所述ECM包含COL1的c-末端前肽，或三螺旋或非还原γ型纤维状胶原，或两者。


11.一种制造细胞外基质(ECM)的方法，所述方法包括：
在基底上培养成纤维细胞和/或间充质干细胞(MSC)，所述基底包括至少两个表面，所述培养是无血清和无异种的，直到所述成纤维细胞和/或MSC在所述至少两个表面上限定出三维形状，并且至少80％的成纤维细胞和/或MSC停止其细胞周期；
此后使所述成纤维细胞和/或MSC与血清接触至少约两周，由此所述成纤维细胞和/或MSC产生可溶性成熟ECM，因此产生包含可溶性成熟ECM和所述成纤维细胞或MSC的溶液，其中所述溶液是无异种的；和
将所述可溶性成熟ECM与所述生产成纤维细胞分离，从而制造所述ECM，其中所述ECM是...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗西斯·克里斯多夫·齐格勒，
申请(专利权)人：突破技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US