一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向CD133的嵌合抗原受体CAR‑CD133和靶向AFP的嵌合抗原受体CAR‑AFP，该T细胞能同时识别两种不同的肝癌靶点CD133及AFP，对肿瘤细胞的靶向识别性广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，扩大了其广谱杀伤性，提升了肿瘤杀伤能力，增强了免疫细胞的体内持久性。本发明专利技术还提供了该靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内排位第五位的最常见的恶性肿瘤。在我国，每年由于肝癌死亡的人数超过十万。而嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorT-Cell，CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势而弥补了传统疗法的弊端，受到了广泛的关注和研究。它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，以达到清除恶性肿瘤细胞的目的，被认为最有可能彻底清除肿瘤细胞的方法。但目前CAR-T技术的应用还局限于白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤，在诸如肝癌等实体肿瘤中的应用较少，且在复杂的肿瘤微环境中(如多种肿瘤抗原同时出现的情况)，CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床应用。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种针对肝癌的靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。该T细胞可高效靶向至肝癌细胞的两个肿瘤靶点，对肝癌细胞的靶向性高、识别性较广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，具有较强的肝癌细胞杀伤性。第一方面，本专利技术提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CD133的嵌合抗原受体CAR-CD133和带靶向AFP的嵌合抗原受体CAR-AFP的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述CAR-CD133和所述CAR-AFP的双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-CD133包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD133的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-AFP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向AFP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向CD133的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向AFP的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。其中，当所述靶向性抗肿瘤T细胞为带CAR-CD133和CAR-AFP的双靶点CAR-T时，嵌合抗原受体CAR-CD133和CAR-AFP的分布位置不作限定，可以是交替分布(例如ABAB…，AABABB…)或依次分布(例如AAAA…BBB…)，但两者之间并无共价连接，此时它们相应的CD133单链抗体和AFP单链抗体之间也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CD133的单链抗体或所述靶向AFP的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。上述提及的CD133为5次跨膜糖蛋白，是公认的肿瘤干细胞标志物，在多种肿瘤组织中表达，可能与临床肝癌复发和转移有关，是较为常用的肝癌干细胞标志物。AFP(甲胎蛋白)与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物。而本专利技术上述靶向性抗肿瘤T细胞带有CAR-CD133和CAR-AFP，能同时识别两种不同的肝癌靶点CD133及AFP，有效避免肝癌细胞出现免疫逃逸。优选地，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带CAR-CD133和带CAR-AFP的双靶点嵌合抗原受体T细胞。这种情况下可降低在临床免疫治疗中所需要的T细胞数目。可选地，所述靶向CD133的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向AFP的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。本专利技术所述靶向CD133的单链抗体保留有对CD133抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有CD133抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向AFP的单链抗体也保留有对AFP抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有AFP抗原的B系恶性淋巴细胞。可选地，所述靶向CD133的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该包括与SEQIDNO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:1。所述靶向AFP的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。本专利技术中，所述CAR-CD133中的胞外铰链区用于促进所述靶向CD133的单链抗体与肿瘤细胞上的CD133抗原结合；类似地，所述CAR-AFP中的胞外铰链区用于促进所述靶向AFP的单链抗体与肿瘤细胞上的AFP结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:9。本专利技术中，所述CAR-CD133中的跨膜区用于固定所述靶向CD133的嵌合抗原受体CAR-CD133；类似地，所述CAR-AFP中的跨膜区用于固定所述靶向AFP的嵌合抗原受体CAR-AFP。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQIDNO：12所示的核苷酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的编码基因还可包括与SEQIDNO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列。本专利技术中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。在本专利技术一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CD133的嵌合抗原受体CAR-CD133和带靶向AFP的嵌合抗原受体CAR-AFP的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-CD133包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD133的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-AFP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向AFP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；/n其中，所述靶向CD133的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向AFP的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
20181229 CN 201811640662X1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CD133的嵌合抗原受体CAR-CD133和带靶向AFP的嵌合抗原受体CAR-AFP的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CD133的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-AFP的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-CD133包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CD133的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-AFP包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向AFP的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；
其中，所述靶向CD133的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，所述靶向AFP的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向CD133的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，所述靶向AFP的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。


3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-CD133的氨基酸序列包括如SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-AFP的氨基酸序列包括如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。


4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-CD133和/或CAR-AFP的编码基因。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。


6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)分别提供靶向CD133的嵌合抗原受体CAR-CD133的编码基因和靶向AFP的嵌合抗原受体CAR-AFP的编码基因；
所述CAR-CD133的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CD133的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何清，廖雪姣，王辉，唐奇远，舒丹，唐娴，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44