一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用，属于基因文库构建与应用领域，利用载体系统和CRISPR文库创建特异性、覆盖全基因组或部分功能基因的可控型突变细胞库，对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；对其进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。本发明专利技术的筛选方法简单高效、能在全基因组范围筛选目标病毒相关宿主因子，准确度高、可控性强，成本低，可实现规模化筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用
本专利技术涉及CRISPR/Gas9
，具体涉及利用CRISPR文库，制备突变细胞库等技术手段，规模化筛选禽流感病毒必需宿主因子或限制性宿主因子的方法。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒引起的一种疾病，家禽感染后，可表现为呼吸道疾病和产蛋量下降，严重时导致全身性疾病，死亡率可达100％。禽流感的流行和爆发会造成家禽养殖业严重的经济损失。同时，禽流感病毒还可以感染人类和其他哺乳动物，对人类的生命安全和公共卫生造成巨大威胁。流感病毒存在多种亚型，并且会随时间和空间推移发生抗原漂移和变异，不断进化出新的亚型，所以传统的禽流感疫苗或抗病毒药物不能预防和治愈所有亚型的流感病毒感染。这就需要寻找宿主本身与流感病毒感染相关的因子，研究广谱的抗病毒方法。宿主因子即宿主细胞中与病毒感染和复制过程相关的因子，通常可以分为两类：一类是限制性宿主因子，即抑制病毒感染和复制的宿主因子，如：干扰素及干扰素刺激因子等；另一类是支持病毒复制，病毒感染必需的宿主因子，如：细胞表面病毒受体等。目前已知与禽流感病毒感染相关的宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)利用载体系统和CRISPR文库创建覆盖靶向模式动物全基因组或部分功能基因的突变细胞库；/n(2)对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；/n(3)对抗病毒突变细胞库进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用载体系统和CRISPR文库创建覆盖靶向模式动物全基因组或部分功能基因的突变细胞库；
(2)对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；
(3)对抗病毒突变细胞库进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变细胞库通过以下方法创建得到：
1)筛选优化的sgRNA序列，构建CRISPR文库；
2)将CRISPR文库中的sgRNA序列导入载体，构建载体-CRISPR文库，建立核酸酶蛋白表达系统；
3)将载体-CRISPR文库和核酸酶蛋白表达系统转染入细胞，筛选后剔除转基因阴性的细胞，得到突变细胞库。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述优化的sgRNA长度20nt，每个基因设计5-6条sgRNA；
优化的sgRNA序列通过以下方法筛选得到：设计针对每个基因的sgRNA，在转录sgRNA的载体中，将PAM序列添加至sgRNA序列之后、茎环结构的转录终止序列之前；或在转录sgRNA的载体中，将与U6之后sgRNA相同的sgRNA序列以及PAM序列添加至茎环结构的转录终止序列之后；
所述茎环结构的转录终止序列如SEQIDNO.1所示，所述PAM序列为NGG或GGG。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴森，郭紫航，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11