EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法以及通过该方法获得的稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的B淋巴瘤细胞株。本发明专利技术通过设计特异性的引物序列，并通过大量实验确定了最优的转染方法和转染条件，从而比脂质体转染更高效地获得阳性细胞。本发明专利技术的方法和细胞株可以为研究EB病毒LMP1致病机制提供有力的方法和工具，也可用于抗体制备、药物研发以及基因治疗中。

【技术实现步骤摘要】
EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体地涉及一种EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用。
技术介绍
Epstein-Barr(EB)病毒是一种嗜B淋巴细胞的DNA病毒，越来越多的研究证实EB病毒感染与肿瘤及免疫系统疾病相关。EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP)1主要表达于EB病毒Ⅱ型和Ⅲ型潜伏期感染，是维持其在人体潜伏感染状态的重要片段。研究发现，LMP1也是EB病毒致瘤性的关键分子，与系统性红斑狼疮(Systemiclupuserythematosus,SLE)、霍奇金淋巴瘤(HL)、移植后淋巴组织增殖疾病(PTLD)相关，机制涉及CD40、核转录因子NF-kB和干扰素通路的活化，以及一些细胞因子如白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)的调控等。其对体外培养的淋巴与血液细胞的影响和机制仍待进一步探究。LMP1基因作为一种病毒基因兼致癌基因，采用病毒包装载体具有较大危险性，因此非病毒载体系统具有低毒性的优点，但与此同时，与LMP1相关的自身免疫性疾病与血液系统疾病所涉及的多为悬浮细胞，质粒转染难度较大且转染效率低下。Ramos细胞来源于人Burkitt’s淋巴瘤患者B淋巴瘤细胞，为一种EB病毒阴性细胞，表达IL-4受体与低亲和性IgE受体(CD23)，可分泌IgM，表达膜型和分泌型的免疫球蛋白。该细胞株广泛用于多个领域的B细胞信号通路及功能研究。因此，在Ramos细胞株中建立稳定表达LMP1的方法以及稳定表达LMP1的Ramos细胞株，可进行细胞功能学检测以及细胞通路研究，为研究LMP1致病机制提供工具与方法，也可进一步单克隆化为抗体制备、药物研发以及基因治疗提供支持。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术设计了特定的引物序列，利用真核表达载体通过带G418抗性的重组质粒结合电穿孔条件的优化，从而获得了一种EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株。在第一个方面，本专利技术提供了一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(下文中简称为“LMP1”)的方法(在下文中有时简称为“本专利技术的方法”)，该方法包括以下步骤：1)将含有EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的重组质粒通过电穿孔法转染至B淋巴瘤细胞中；2)利用G418筛选步骤1)中所获得的细胞克隆，从而获得LMP1稳定高表达(或过表达)的细胞株；其中所述EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的序列如SEQIDNO:1所示。在一个具体实施方案中，步骤1)中的重组质粒是利用质粒载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP构建的，所述重组质粒包含CMV启动子、pcDNA3.1序列、G148抗性基因、EGFP示踪基因以及目的基因(即，EB病毒潜伏期膜蛋白1基因序列，序列如SEQIDNO:1所示)。在一个具体实施方案中，步骤1)包括以下步骤：A.设计引物：参考PubMed中EBVLMP1基因编码区(CDS区)序列共1215个碱基(如SEQIDNO:1所示)，利用primer5软件设计引物，并加上pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP中的AgeⅠ与ClaⅠ酶切序列；B.用上述引物将合成至puc57克隆载体的LMP1片段PCR扩增，回收纯化目的片段；C.用ClaⅠ与AgeⅠ内切酶线性化载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP，切胶回收；D.将目的片段无缝连接(可以采用本领域中熟知的各种市售无缝克隆试剂盒，例如，HB-infusionTM无缝克隆试剂盒)至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP载体获得重组质粒；E.重组质粒转化于感受态，行菌液PCR验证及测序验证。在一个优选实施方案中，步骤1)中所述的构建EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP1)重组质粒的步骤中所采用的引物如下：上游引物：5’-TGTGACCGGCGCCTACGAATTCGCCACCATGGAACGCGACCTTGA-3’(SEQIDNO:2)；下游引物：5’-ATCGATGGACCGGTCGGGATCCGTCATAGTAGCTTAGCTGAA-3’(SEQIDNO:3)。在一个优选实施方案中，步骤B中所采用的PCR扩增程序是：95℃5min；94℃20s,55℃20s,72℃60s，27个循环；72℃10min。在一个优选实施方案中，步骤B中所采用的PCR扩增反应体系如下：bufferforKODplus5μl，MgSO4(25mM)2μl，dNTPs(2mM)5μl，上下游引物各1μl，KODplusDNA聚合酶1μl,puc57-LMP1质粒(质粒模板，合成于上海汉恒生物科技公司)1μl，超纯水34μl。在一个实施方案中，步骤1)的转染步骤包括：用无血清培养基制备B淋巴瘤细胞悬液，对混合了重组质粒的细胞悬液进行电击，电击条件为：电容为1000μF、细胞密度为5×106～5×107个/ml，电压140V，其中细胞悬液与重组质粒的混合比例为200μl细胞悬液：5μg重组质粒。在一个优选实施方案中，步骤2)的筛选步骤包括：在电击后去除死亡细胞，将剩余细胞转移到细胞培养板中进行单孔培养。在一个优选实施方案中，本专利技术的方法还包括：3)纯化步骤，所述纯化步骤包括下列步骤：将培养了48～72小时，优选64小时后的单孔细胞传代于5孔中，使用含G418的培养基继续培养至少20天，优选至少30天。在一个优选实施方案中，步骤2)中所使用的G418浓度为600μg/ml。在一个优选实施方案中，在纯化步骤中，在继续培养中G418浓度为300～600μg/ml。在第二个方面，本专利技术提供了一种稳定表达LMP1的B淋巴瘤细胞株(下文中有时简称为“本专利技术的细胞株”)，所述细胞株是通过本专利技术的方法获得的。在第三个方面，本专利技术提供了本专利技术的细胞株在制备用于治疗EB病毒相关疾病的药物中的用途。在本专利技术中，B淋巴瘤细胞可以是提取自任何哺乳动物或人的B淋巴瘤细胞或建系细胞，优选是人的B淋巴瘤细胞或建系细胞。在一个优选实施方案中，B淋巴瘤细胞是RAMOS细胞系(该细胞系是一种在体外稳定增殖传代的EB病毒阴性人B淋巴瘤细胞系)。在本专利技术中，哺乳动物包括但不限于，牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物，优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物，更优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠和猴。在本专利技术中，EB病毒相关疾病包括EB病毒感染性疾病和与EB病毒密切相关的疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮(Systemiclupuserythematosus,SLE)、霍奇金淋巴瘤(HL)、移植后淋巴组织增殖疾病(PT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：/n3)将含有EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的重组质粒通过电穿孔法转染至B淋巴瘤细胞中；/n4)利用G418筛选步骤1)中所获得的细胞克隆，从而获得LMP1稳定高表达的细胞株；/n其中所述EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
3)将含有EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的重组质粒通过电穿孔法转染至B淋巴瘤细胞中；
4)利用G418筛选步骤1)中所获得的细胞克隆，从而获得LMP1稳定高表达的细胞株；
其中所述EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的序列如SEQIDNO:1所示。


2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中的所述重组质粒是利用质粒载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP构建的，所述重组质粒包含CMV启动子、pcDNA3.1序列、G148抗性基因、EGFP示踪基因以及EB病毒潜伏期膜蛋白1基因。


3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤1)的转染步骤中所使用的电击条件为：电容为1000μF、细胞密度为5×106～5×107个/ml，电压140V，其中B淋巴瘤细胞的细胞悬液与重组质粒的混合比例为200μl细胞悬液：5μg重组质粒。


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【专利技术属性】
技术研发人员：孙明姝，张令歌，罗兵，刘雯，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东;37