一种嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种嵌合抗原受体T细胞及其应用。所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD‑L1的嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体T细胞同时表达CD19 CAR结构与PD‑L1 CAR结构，所述PD‑L1 CAR与肿瘤细胞表达的PD‑L1结合后可通过胞内传递激活信号。因此，所述嵌合抗原受体T细胞不仅可以靶向识别表达CD19的肿瘤细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD‑1对T细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解CAR‑T治疗的耐药性问题，为CAR‑T治疗以及过继回输免疫细胞治疗提供了一种新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体T细胞及其应用
本专利技术属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，尤其涉及一种同时表达两种嵌合抗原受体的T细胞及其应用。
技术介绍
过继性免疫治疗(AdoptiveCellTransferTherapy，ACT)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。近年来，嵌合抗原受体(ChimericAntigenreceptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-modifiedTlymphocyte，CAR-T)疗法在血液肿瘤的治疗上取的了显著疗效，特别是对于急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia，ALL)和B细胞淋巴瘤，缓解率达到80％左右。其中，CAR-T设计的关键是选择适当的肿瘤抗原作为靶标，CD19CAR-T靶向治疗法的效果最为显著，可达70-90％的完全缓解。CD19是簇分化抗原的一种，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。CD19分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B细胞最好的标记。截止2019年，美国FDA批准了两款针对急性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤的CAR-T疗法，Yescarta和Kymriah，也都是以CD19作为靶点。例如，CN108864307A公开了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用。所述信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域。尽管CD19CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的结果，但是研究表明，实体肿瘤比如淋巴瘤和宿主调节细胞诱导的免疫抑制性微环境可能会限制过继性T细胞免疫疗法的潜能。肿瘤可通过刺激T细胞上的免疫抑制受体，例如PD1来逃避免疫监控，这也是CD19CAR-T细胞疗法在淋巴瘤中的疗效不佳的主要原因。PD-L1在肿瘤细胞中的过表达也是耐药机制的一种，可因PD-L1与T细胞上的PD-1结合，而抑制T细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。阻断PD-L1和PD1的结合理论上可以消除PD1信号对T细胞的抑制，激活T细胞的免疫反应。美国FDA已批准三款PD-L1单抗药物对于非小细胞肺癌，黑色素瘤和尿路上皮癌等癌症的临床试验，平均缓解率在30％左右。单用PD-L1单抗的疗效还不足以完全治愈肿瘤患者，很多临床III期实验由于没有达到最终目标而失败。因此，本专利技术的目的在于提供一种能够有效治疗肿瘤、降低免疫抑制性的嵌合抗原受体T细胞。
技术实现思路
鉴于现有技术中存在的问题，鉴于抗PD-L1的免疫抑制作用，我们利用CAR来设计转换PD-L1的抑制信号为激活信号，从而为CAR-T治疗以及过继回输免疫细胞治疗提供一种新的方法和思路。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD-L1特异性结合抗原的嵌合抗原受体。本专利技术将靶向CD19的CAR与靶向PD-L1的CAR共同构建于同一慢病毒载体，进而转入T细胞当中得到所述CAR-T细胞，使该基因修饰的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19细胞，同时，PD-L1嵌合抗原受体能够把PD-L1/PD1传导的抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制。所述双CAR结构的同时表达，能够提高所述CAR-T细胞的抗肿瘤效果，缓解CAR-T治疗的耐药性问题。作为本专利技术优选的技术方案，所述CD19嵌合抗原受体包括：CD19抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。优选地，所述CD19抗原结合结构域包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。优选地，所述CD19嵌合抗原受体包括如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。作为本专利技术优选的技术方案，所述PD-L1嵌合抗原受体包括：PD-L1抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。PD-L1嵌合抗原受体能够把PD-L1/PD1传导的本来是抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号。同时，肿瘤细胞中表达的PD-1，PD1-CD28嵌合受体借助于PD-1提供的信号，化抑制为刺激，促进T细胞的抗肿瘤活性。为了促进PD-L1对于抑制免疫逃逸的作用，本专利技术通过噬箘体文库筛选到的不同PD-L1抗体，并对PD-L1的靶向序列进行了优化，从多个序列中，筛选出能使CAR活性最高的PD-L1序列。优选地，所述PD-L1抗原结合结构域包括如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示的任意一种氨基酸序列，优选为SEQIDNO.3。其中，SEQIDNO.3所示的氨基酸序列为：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDSWIHRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNSKNTLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS；SEQIDNO.4所示的氨基酸序列为：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASSYIMMRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNAKNSLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS；SEQIDNO.5所示的氨基酸序列为：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASFLYSG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD-L1的嵌合抗原受体。/n

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD-L1的嵌合抗原受体。


2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CD19嵌合抗原受体包括：CD19抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；
优选地，所述CD19抗原结合结构域包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域；
优选地，所述CD19嵌合抗原受体包括如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述PD-L1嵌合抗原受体包括：PD-L1抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；
优选地，所述PD-L1抗原结合结构域包括如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示的任意一种氨基酸序列，优选为SEQIDNO.3；
优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域；
优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体包括如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7或SEQIDNO.8所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CD19嵌合抗原受体和PD-L1嵌合抗原受体通过2A或IRES进行连接；
优选地，所述2A的氨基酸序列包括如SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。

...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏小平，李锐，
申请(专利权)人：格源致善上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31