一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法。所述培养基含有以下成分：Advanced DMEM/F12、FBS、双抗、N‑2、Noggin、B‑27、EGF、FGF‑10、Y‑27632、A83‑01、SB202190、R‑Spondin、N‑乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、Wnt3A、HGF和Primocin

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法。
技术介绍
肝细胞癌在世界癌症死亡率排名中排名第二位，其具有高转移率、低预后率、难以治疗等特点。肿瘤的恶性侵袭与转移，导致患者肿瘤复发，治疗效果不佳，预后效果比较差。肿瘤细胞一旦转化为恶性细胞，它的侵袭和迁移能力也会变得异常强大。肿瘤细胞并不只限于单个细胞的迁移。在许多肿瘤类型中，通常观察到的侵袭单元是细胞群，群体的行为决定恶性功能。二维(two-dimensional，2D)细胞培养已广泛应用于生物学研究，但在二维水平生长的细胞并不能精确地模拟体内的状态。相比于2D培养，三维(three-dimensiona，3D)细胞培养通过运用再造细胞外基质(比如Matrigel、collagenI、水凝胶等)、构建支架或借助一定的载体，能够模拟体内细胞生存环境，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境，更有利于开展肿瘤细胞向周围组织侵袭和迁移的研究，以及建立更接近体内真实环境的药敏筛选模型。但目前的肿瘤类器官3D培养技术还存在一定不足(Science364,2019，952–955.)，如：不同器官肿瘤类模型形态不易区分，缺乏代表性；培养周期较长，培养价格相对还是太高；类器官培养多局限于基质胶、水凝胶等基质材料中，该类方式限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，交换局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除。针对上述不足，本专利技术提供了一种肝肿瘤无支架3D类器官的培养方法，并将其应用于抗肿瘤药物药敏筛选。该培养体系可实现肝肿瘤原代细胞的外快速增殖、提高肝肿瘤3D类器官建模及培养成功率、大幅度降低培养成本和培养周期。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案：一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，由血清替代物N2和B27、Noggin、双抗、表皮生长因子、成纤维生长因子、选择性ROCK1抑制剂、ALK5抑制剂、p38MAPK抑制剂、N-乙酰半胱氨酸、R-Spondin蛋白、烟酰胺、Wnt3A细胞因子、肝细胞生长因子、PrimocinTM、胎牛血清和基础培养基AdvancedDMEM/F12组成。作为本专利技术进一步的方案，所述血清替代物N2和B27的终浓度分别为1％和2％(体积百分含量)；所述Noggin的终浓度为100ng/mL；所述双抗的终浓度为1-2％(体积百分含量)；所述表皮生长因子(EGF)的终浓度为50-100ng/mL；所述成纤维生长因子(FGF-10)的终浓度为10-20ng/mL；所述选择性ROCK1抑制剂(Y-27632)的终浓度为10-20μmol/L；所述ALK5抑制剂(A83-01)的终浓度为0.5-1.0μmol/L；所述p38MAPK抑制剂(SB202190)的终浓度为5-15μmol/L；所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-1.5mmol/L；所述R-Spondin蛋白的终浓度为100-200ng/mL；所述烟酰胺的终浓度为5-15mmol/L；所述Wnt3A细胞因子的终浓度为50-100ng/mL；所述肝细胞生长因子(HGF)的终浓度为50-100ng/mL；所述PrimocinTM的终浓度为100-200μg/mL；胎牛血清的终浓度为5％(体积百分含量)；余量均为AdvancedDMEM/F12。表1肝癌类器官专用完全培养基组成作为本专利技术进一步的方案，双抗(青霉素/链霉素混合液)中添加有GlutaMax成分，该成分的添加有利于类器官3D细胞球的生长。一种肝肿瘤无支架类器官培养方法，将将分离获取的肝肿瘤原代细胞接种至超低吸附U型96孔板中，并加入上述培养基，对孔板进行离心，1000rpm离心3min，促进肝肿瘤原代细胞聚集，培养至形成肝肿瘤组织类器官。作为本专利技术进一步的方案，肝肿瘤原代细胞接种数量范围为1000～12000细胞/孔。作为本专利技术进一步的方案，纯化后的原代细胞接种数量范围为2000-6000细胞/孔。作为本专利技术进一步的方案，细胞接种且离心孔板后，在24h内可形成凝聚的细胞球形态，此时为了维持初步形成的细胞球的稳定，在接种前4天内每2天更换一次培养基，4天后再每天更换培养基，以维持养分的供应。所用基础培养基为AdvancedDMEM/F12培养基。所用原代细胞抗生素为PrimocinTM，此成分的添加有助于避免原代细胞的污染，尤其可避免乙肝病毒的感染。上述肝癌类器官培养方法中，必须添加R-Spondin，此成分有助于肝癌类器官的形成。上述肝癌类器官培养方法中，必须添加N-乙酰半胱氨酸，此成分有助于维持肝癌类器官外形的规则圆润。作为本专利技术进一步的方案，将手术取下的肝癌组织剪碎成1mm2大小的组织碎块，随后使用含双抗的PBS溶液漂洗干净，100g离心2min收集组织块沉淀，加入2-3倍体积的组织消化液，充分混匀后37℃消化30～60min，每隔10min观察一次消化状态，并用力震荡，直至观察到组织出现弥散状态时即可终止消化，收集细胞；分离的原代肿瘤细胞悬液1000rpm/min离心3分钟，除上清，收集沉淀，加入适量专用培养基重悬，利用差速贴壁法进行细胞纯化。纯化后的细胞进行接种，按照2500细胞/孔的密度接种至超低吸附96孔板U形培养板中，每孔补充表1的专用培养基150μL，放入37℃、5％CO2培养箱中培养；接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成3D细胞球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，3-4天之后达到稳定，体积开始增大，每天更换一次完全培养基，所培养的球体形态完整规则、圆润饱满、边界清晰，连续培养10天仍可维持细胞球形态与活力的稳定。作为本专利技术进一步的方案，所述组织消化液为0.1％Ⅰ型胶原酶+0.1％Ⅳ型胶原酶+Hank's溶液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的专用肝肿瘤类器官培养基针对肝癌患者来源肿瘤细胞的生长特点，实现肿瘤原代细胞的体外增殖，并可快速构建无支架肝肿瘤类器官，24小时内即可形成3D细胞球。本专利技术提供的无支架肝肿瘤类器官培养基及培养方法，可促进肝肿瘤类器官的长期稳定生长，形成的类器官保留了患者肿瘤组织的异质性，适用于体外肝癌化疗药的药敏检测及肿瘤相关的研究。本专利技术为化疗药物的体外药敏筛选提供了一种有效的体外研究模型，可以准确预测患者对药物的反应，有助于临床患者的个体化治疗，降低耐药，提高疗效。附图说明图1为本专利技术实施例建立类器官体系效果图(其中a为接种后1天，b为接种后5天，c为接种后10天)。图2为本专利技术实施例完全培养基中缺少不同成分时所形成类器官的外观形态差异对比图(其中a为专用完全培养基，b为缺R-Spondin培养基，c为缺N-乙酰半胱氨酸培养基)。图3为本专利技术实施例2D普通培养原代肝癌细胞免疫荧光鉴定结果图(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，由血清替代物N2和B27、Noggin、双抗、表皮生长因子、成纤维生长因子、选择性ROCK1抑制剂、ALK5抑制剂、p38 MAPK抑制剂、N-乙酰半胱氨酸、R-Spondin蛋白、烟酰胺、Wnt3A细胞因子、肝细胞生长因子、Primocin

【技术特征摘要】
1.一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，由血清替代物N2和B27、Noggin、双抗、表皮生长因子、成纤维生长因子、选择性ROCK1抑制剂、ALK5抑制剂、p38MAPK抑制剂、N-乙酰半胱氨酸、R-Spondin蛋白、烟酰胺、Wnt3A细胞因子、肝细胞生长因子、PrimocinTM、胎牛血清和基础培养基AdvancedDMEM/F12组成。


2.根据权利要求1所述的用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，所述血清替代物N2和B27的终浓度分别为1％和2％；所述Noggin的终浓度为100ng/mL；所述双抗的终浓度为1-2％；所述表皮生长因子的终浓度为50-100ng/mL；所述成纤维生长因子的终浓度为10-20ng/mL；所述选择性ROCK1抑制剂的终浓度为10-20μmol/L；所述ALK5抑制剂的终浓度为0.5-1.0μmol/L；所述p38MAPK抑制剂的终浓度为5-15μmol/L；所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-1.5mmol/L；所述R-Spondin蛋白的终浓度为100-200ng/mL；所述烟酰胺的终浓度为5-15mmol/L；所述Wnt3A细胞因子的终浓度为50-100ng/mL；所述肝细胞生长因子的终浓度为50-100ng/mL；所述PrimocinTM的终浓度为100-200μg/mL；胎牛血清的终浓度为5％；余量均为AdvancedDMEM/F12。


3.根据权利要求1所述的用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，双抗中添加有利于类器官3D细胞球的生长的GlutaMax成分。


4.一种肝肿瘤无支架类器官培养方法，其特征在于，将将分离获取的肝肿瘤原代细胞接种至超低吸附U型96孔板中，并加入上述培养基，对孔板进行离心，1000rpm离心3min，促进肝肿瘤原代细胞聚集，培...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗国安，王义明，范雪梅，罗喆明，
申请(专利权)人：江苏信安佳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32