一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法技术

本发明专利技术公开了一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法，培养基由EGF、Noggin、Y‑27632、A83‑01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte‑SFM组成。培养方法是将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种超低吸附U型细胞培养板中，加入鼻咽癌类器官专用培养基，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO

【技术实现步骤摘要】
一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法
本专利技术涉及肿瘤类器官培养领域，进一步涉及鼻咽癌类器官培养领域，特别是用于鼻咽癌类器官专用培养基、无支架培养方法。
技术介绍
鼻咽癌来源于鼻咽上皮细胞，是鼻咽部上皮组织发生的恶性肿瘤，在流行病学上有明显的地域特点，高发于我国南部和东南亚地区。鼻咽癌具有与其他头颈部鳞癌不同的发病因素和肿瘤生物学行为。随着诱导化疗、同期放化疗和适形调强放疗在鼻咽癌治疗中的广泛应用，鼻咽癌的局部控制率得到了明显的改善。但是，疗后的局部/区域复发与远处转移仍然常见，是鼻咽癌治疗失败的主要原因，而且常常难以预料并予以有效预防。另外，目前临床上用于抗鼻咽癌的药物主要以传统的抗恶性肿瘤药如顺铂、氟尿嘧啶为主，但是常产生耐药性，且不良反应严重。并且对于已经接受过初次综合治疗的患者，复发的肿瘤细胞的敏感性较前下降，同时患者的身心状况较初次治疗也存在不同程度的下降。如何能够从众多抗癌药物中快速寻找出对鼻咽癌/复发转移癌敏感的药物，最大程度减少药物耐药性的出现，避免延误最佳治疗时机，成为鼻咽癌临床治疗亟待解决的问题之一。类器官，是一类由干细胞，包括多能干细胞和成体干细胞，在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。人源肿瘤类器官能够取自组织癌变过程中各个阶段的肿瘤组织，突破性地提高了肿瘤细胞体外培养的效率，同时最大程度地维持了肿瘤细胞在体内的特征，因而得到广大研究人员的青睐，被《NatureMethods》评为2017年生命科学领域年度技术。目前鼻咽癌肿瘤类器官培养已有研究报道，但是其培养多局限于基质胶中，该培养方式限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，当类器官形成较大的组织后，循环系统的缺乏和氧气养分交换的局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除；并且因3D细胞球周围有外基质而无法进行原位光学检测，而去除外基质的过程不仅繁琐，一定程度上还会对细胞活性造成影响，干扰实验结果的真实性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中培养类器官需要支架材料，导致细胞生长不良、支架材料去除困难等缺陷，提供一种可以无需支架材料的鼻咽癌专用培养基，还提供了一种配套的培养方法，可快速形成类器官，且大小均一、形状规则，遗传及生物学性状稳定。本专利技术提供的鼻咽癌类器官专用培养基，由以下组分组成：EGF、Noggin、Y-27632、A83-01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte-SFM。EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，具有很强的生理活性，如能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值。Noggin是一种重要的胚胎蛋白，在胚胎背腹轴模式形成、神经管发育及神经诱导方面有重要功能。Y-27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，具有防止细胞凋亡的作用。A83-01是一种TGF-βI型受体ALK5激酶、I型激活素ALK4以及I型节点受体ALK7的选择性抑制剂，加入培养基发挥维持细胞干性，抑制细胞分化的作用。SB202190是一种有效的p38MAPK抑制剂，靶向作用于p38α/β，对分离的原代肿瘤细胞具有保护作用。bFGF是碱性成纤维细胞生长因子。氢化可的松：糖皮质激素，具有抗炎及免疫抑制作用。Insulin：胰岛素，可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质；还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用青霉素/链霉素双抗：是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内，抑制细菌生长；避免细胞污染。FBS：胎牛血清，提供细胞生长、贴壁必须的营养成分和因子，如提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物及因子，以及主要的低分子营养物。Keratinocyte-SFM：一种细胞基础培养基。优选的，上述鼻咽癌类器官专用培养基，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：EGF10-30ng/mL、Noggin100-500ng/mL、Y-2763210-100μM、A83-010.5-1.5μM、SB20219010-50μM、bFGF0.5-50ng/mL、氢化可的松20-200ng/mL、Insulin0.5-1.5μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS1-5％。优选的，上述鼻咽癌类器官专用培养基，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：EGF20ng/mL、Noggin200ng/mL、Y-2763210μM、A83-010.6μM、SB20219010μM、bFGF5ng/mL、氢化可的松80ng/mL、Insulin1μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS2％。本专利技术还提供了一种使用以上任一所述鼻咽癌类器官专用培养基培养3D鼻咽癌类器官的方法，包括以下步骤：将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种到鼻咽癌类器官专用培养基中，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中进行培养，每隔2-3天更换一次无支架培养基。离心的目的是使细胞通过物理方式在培养初期聚集成小团，便于后期沿着小团进行外延生长繁殖。优选的，上述方法中，所述肿瘤细胞接种的器皿为超低吸附U型细胞培养板。优选的，上述方法中，所述肿瘤细胞接种的器皿为信安佳96孔类器官专用培养板。信安佳96孔类器官专用培养板是江苏信安佳医疗科技有限公司研制的专门用于培养3D类器官的培养板，使用本专利技术培养基配合该培养板后，培养时间更短，培养效果更佳优选的，上述方法中，所述离心条件为温度4℃，转速1000rpm/min，时间3分钟。优选的，上述方法中，所述鼻咽癌肿瘤细胞是由鼻咽癌肿瘤组织经预处理获得，预处理步骤为：使用4℃预冷的组织洗涤液将鼻咽癌肿瘤组织清洗干净，在离心管内用灭菌眼科剪将组织剪成小块；加入10倍体积的组织消化液后，将离心管放置到37℃恒温箱内摇床，消化30分钟；用200目尼龙网筛过滤消化液中的细胞，滤液中加入5mL含体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；剩余组织加入组织消化液进行二次消化，30分钟后过滤收集滤液，加入体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；合并两次消化获得滤液，1000rpm，4℃，离心3min，弃上清，所得细胞进行活细胞计数。优选的，上述方法中，所述组织洗涤液用PBS配制，其成分含量如下：青霉素/链霉素500U/mL，两性霉素B12.5mg/L。优选的，上述方法中，所述组织消化液用Hank's溶液配制，其成分含量如下：Ⅰ型胶原质量浓度0.1％，Ⅳ型胶原质量浓度0.1％。本专利技术提供的鼻咽癌类器官专用培养基及培养方法，具有如下有益效果：本专利技术的培养基在培养类器官时，无需引入Matrigel等外源性基质作为支架材料，只需将细胞放置在装有该培养基的U型和V型孔板内，借助重力即可促进细胞聚集成团，培养过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鼻咽癌类器官专用培养基，其特征在于，由以下组分组成：EGF、Noggin、Y-27632、A83-01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte-SFM。/n

【技术特征摘要】
1.一种鼻咽癌类器官专用培养基，其特征在于，由以下组分组成：EGF、Noggin、Y-27632、A83-01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte-SFM。


2.根据权利要求1所述的鼻咽癌类器官专用培养基，其特征在于，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF10-30ng/mL、Noggin100-500ng/mL、Y-2763210-100μM、A83-010.5-1.5μM、SB20219010-50μM、bFGF0.5-50ng/mL、氢化可的松20-200ng/mL、Insulin0.5-1.5μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS1-5％。


3.根据权利要求1所述的鼻咽癌类器官专用培养基，其特征在于，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF20ng/mL、Noggin200ng/mL、Y-2763210μM、A83-010.6μM、SB20219010μM、bFGF5ng/mL、氢化可的松80ng/mL、Insulin1μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS2％。


4.使用权利要求1-3任一所述鼻咽癌类器官专用培养基培养鼻咽癌无支架3D类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种到鼻咽癌类器官专用培养基中，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO2...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗国安，王义明，范雪梅，罗喆明，
申请(专利权)人：江苏信安佳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32