仿生肝类器官培养模型及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞体外培养技术和药物毒性筛选领域，具体涉及仿生肝类器官培养模型构建及其用于药物毒性评估的应用。本发明专利技术提供的仿生肝类器官培养模型的构建方法包括，将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养和消化，制成细胞悬液，并将细胞悬液分别接种到凹槽装置和多孔膜上，之后将多孔膜组装到凹槽装置上，并在培养箱内培养，以制成仿生肝类器官培养模型。本发明专利技术结构独特，双细胞双靶点，可用于主要靶点肝细胞的毒性评估也可用于非实质内皮细胞的毒性评估，为药物毒性筛选提供新思路及有力的工具。

Bionic liver organ culture model and its application

【技术实现步骤摘要】
仿生肝类器官培养模型及其应用
本专利技术涉及细胞体外培养技术和药物毒性筛选领域，具体涉及仿生肝类器官培养模型构建及其用于药物毒性评估的应用。
技术介绍
药物性肝损伤(Druginducedliverinjury,DILI)是药物研发失败、上市后被撤回的主要原因之一。由于动物模型缺乏准确的预测性及3R原则(即替代，减少，优化)的大力推行，因此建立可靠的体外人源肝细胞模型并用于药物肝毒性筛选研究尤为重要。然而，研究发现肝细胞在体外常规培养过程中易丧失其结构特征和分化能力，其主要是由于肝细胞缺乏体内肝脏的三维结构及细胞间相互作用，从而导致肝功能和活性的降低，进而影响其用于药物肝毒性筛选评估。因此这些问题的存在在建立可靠的体外肝模型中不容忽视。当前，体外三维肝细胞球培养相对于常规的二维肝细胞培养在重建体外功能性肝组织具有重要意义。三维细胞球培养为肝细胞提供了一个更接近体内肝组织环境的三维地貌，同质肝细胞间紧密相连可有效的增强肝功能特异性的长期保持。高水平的肝功能可提升细胞对药物的毒性敏感度，更真实的预测体内的药物毒性水平。除三维肝细胞培养，肝细胞与非实质细胞共培养也可有效的提升肝功能。共培养可以模仿体内类似的细胞微环境，主要表现在细胞间的相互作用。在体内，肝在体内是由肝实质细胞和非实质细胞组成。肝实质细胞即肝细胞占肝总体积的80％，是肝功能的主要执行者。非实质细胞包括肝血窦内皮细胞，星状细胞和枯否细胞，其中肝血窦内皮细胞是肝非实质细胞中数量最大的一种细胞，约占肝非实质细胞总数的50％。内皮细胞可分泌许多不同的生长因子，例如VEGF，HGF，NO和TGF-β1等，为肝细胞提供合适的生存微环境，并促进肝细胞增殖和分化，从而直接参与肝脏发育，肝再生和肿瘤发生等多种生理和病理过程。体外肝细胞共培养非实质细胞内皮细胞不仅可以更好地重建体内微环境，实现异质细胞间相互作用，而且可以更真实地反映实际肝细胞特性。除此之外，药物引起肝损伤不仅是表现在肝细胞坏死，同时也体现在非实质细胞的损害，例如环磷酰胺引起的肝血管损害。因此，肝细胞-内皮细胞共培养模型相比常规的肝细胞单独培养模型更适合用于药物筛选。然而目前暂无肝细胞与内皮细胞共培养模型及用于药物毒性筛选方面的研究，尤其是三维肝细胞球与内皮共培养模型尚无尝试及报道。有鉴于此，构建三维肝细胞球和内皮细胞的共培养模型在药物肝毒性筛选评价具有重要意义，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种仿生肝类器官培养模型，从而更有利于研究药物毒性筛选。仿生肝类器官培养模型内的同质与异质细胞间相互作用可有效的提升三维肝细胞球特异性功能及代谢功能。仿生肝类器官培养模型结构独特，双细胞双靶点，可用于主要靶点肝细胞的毒性评估也可用于非实质内皮细胞的毒性评估。该培养模型的构建为药物肝毒性筛选提供了一个新颖的思路及有力的工具。为了实现上述目的，本专利技术提供的仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于：在所述方法中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，所述方法包括以下步骤：将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养；将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成细胞悬液，备用；将肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养12h-24h，以形成三维肝细胞球；将内皮细胞悬液接种到孔径为0.4-8μm的多孔膜上，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养1h-6h，以形成单层内皮细胞，之后弃去未贴壁的内皮细胞；将多孔膜组装到凹槽装置上，形成仿生肝类器官培养模型；将仿生肝类器官培养模型的培养基加入到多孔膜上，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养。进一步地，所述肝细胞和内皮细胞为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能性干细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞。进一步地，所述肝细胞和内皮细胞来源为人源。进一步地，所述0.4-8μm的多孔膜材质为高分子聚合物、PET或PC膜中的至少任一种。进一步地，所述凹槽由水凝胶或高分子有机硅化合物中的至少任一种制得。进一步地，所述三维肝细胞球为细胞聚集自组装形成无载体支架的细胞球。进一步地，所述三维肝细胞球直径为20-500μm。进一步地，肝类器官培养模型在药物毒性筛选评估中的应用。更进一步地，将药物刺激后的所述仿生肝类器官培养模型培养进行拆分后，对三维肝细胞球和内皮细胞分别进行毒性评估。本专利技术的有益效果是：本专利技术仿生肝类器官培养模型可以很好的重现体内肝的构型及微环境，同时相对于肝细胞单独培养模型，同质和异质细胞间相互作用可有效的提升肝特异功能及代谢功能，进而提升细胞对药物的毒性敏感度。此外，该仿生肝类器官培养模型结构独特，可任意拆分，双细胞双靶点，可同时执行三维肝细胞球和内皮细胞的毒性测试，可有效的提升药物肝毒性评价的可靠性、准确性及全面性。附图说明图1a为采用现有培养液培养与采用本专利技术的仿生肝类器官培养模型的培养基培养(模型培养基)分别培养的肝细胞和内皮细胞的生长状态比较图，其中，标尺为200μm。图1b为采用现有培养液培养与采用本专利技术的仿生肝类器官培养模型的培养基培养(模型培养基)分别培养的肝细胞和内皮细胞的细胞活力的对比图。图2为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)、三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)及内皮细胞培养模型(对照组2)的结构示意图。图3为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)的肝功能的对比图。图4为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)的代谢功能的对比图。图5为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)与内皮细胞培养模型(对照组2)的内皮细胞能量的对比图。图6为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)与三维肝细胞球单独培养模型(对照组1)分别培养的肝细胞对模型药物对乙酰氨基酚、环磷酰胺和他莫昔芬的毒性敏感性的对比图。图7为本专利技术的仿生肝类器官培养模型(模型组)与内皮细胞培养模型(对照组2)分别培养的内皮细胞对模型药物对乙酰氨基酚、环磷酰胺和他莫昔芬的毒性敏感性的对比图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术的仿生肝类器官培养模型中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，并且按如下步骤制得：1)将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养。肝细胞和内皮细胞分别采用所购买厂商的说明书中规定的培养基进行常规培养。此外，肝细胞和内皮细胞为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能性干细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞，并且肝细胞和内皮细胞来源为人源。2)将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成均匀的细胞悬液，备用。3)将均匀的肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养，12h-24h可形成无载体支架的三维肝细胞球。该三维肝细胞球为细胞聚集自组装形成无载体支架的细胞球，并且肝细胞球直径是可控的，其成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于：在所述方法中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，所述方法包括以下步骤：/n将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养；/n将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成细胞悬液，备用；/n将肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的CO

【技术特征摘要】
1.仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于：在所述方法中，三维肝细胞球与单层内皮细胞非接触共培养，所述方法包括以下步骤：
将肝细胞和内皮细胞分别进行常规细胞培养；
将肝细胞和内皮细胞分别消化，制备成细胞悬液，备用；
将肝细胞悬液接种到凹槽装置中，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养12h-24h，以形成三维肝细胞球；
将内皮细胞悬液接种到孔径为0.4-8μm的多孔膜上，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养1h-6h，以形成单层内皮细胞，之后弃去未贴壁的内皮细胞；
将多孔膜组装到凹槽装置上，形成仿生肝类器官培养模型；
将仿生肝类器官培养模型的培养基加入到多孔膜上，置于37℃、5％的CO2培养箱内培养。


2.根据权利要求1所述的仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于，所述肝细胞和内皮细胞为永生化细胞系、原代细胞、衍生自多能性干细胞或包含这些细胞中的至少任一种细胞。


3.根据权利要求1所述的仿生肝类器官培养模型的构建方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗国安，马立东，王乙同，王义明，
申请(专利权)人：江苏信安佳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32