基于细胞团簇3D打印的血管化组织构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医疗材料领域，具体涉及一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,包括如下步骤：微孔板制备、内皮化细胞团簇生成、3D打印和血管化组织的构建，得到血管化组织。

Vascularized tissue construction method based on 3D printing of cell clusters and its application

【技术实现步骤摘要】
基于细胞团簇3D打印的血管化组织构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体的说，涉及一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织快速构建方法和应用。
技术介绍
人体内细胞密度为108-109细胞/cm3，一个有效的体外模型需要同时满足可比拟体内的细胞密度、细胞功能及发生血管化现象。具有高细胞密度与细胞功能的体外仿生血管化组织模型在创伤修复、器官置换、肿瘤微环境机制研究和药物毒性检测领域都具有重要的应用前景。从组织结构的致密性而言：传统的组织工程制备方法，一般是将单个细胞包埋在胞外基质(例如,明胶体系)中进行组织培养，这样制备的组织其细胞密度不高。传统的喷墨式生物打印技术中细胞密度常限制在105到106量级，依靠单个细胞增殖生成团簇，长成的团簇大小均一性差，空间分布呈无序性，同时打印过程中力学、电场、温度等条件易对细胞造成损伤，导致构建的组织模型无法实现与体内可比拟的细胞分布和细胞密度。如图7所示。从组织的培养时间而言：传统的细胞打印依靠单个细胞增殖，利用细胞的自组装能力在体外环境中先形成团簇，再进一步形成所需的组织，一般而言形成细胞团簇需要一周左右的时间，进一步形成血管化组织需要一周左右的时间，整个培养周期长，时效性差。如图7(Bioengineered3Dplatformtoexplorecell-ECMinteractionsanddrugresistanceofepithelialovariancancercells.Biomaterials.2010Nov；31(32):8494-506)和图8(Coaxialbioprintingofcell-ladenvascularconstructsusingagelatin-tyraminebioink.BiomaterSci.2019Aug21)所示。从组织的血管化程度而言：传统的血管化组织制备方法，依靠组织表面内皮涂附，或依靠组织内内皮细胞的自组装，形成的组织内部未发生血管化或血管化程度低，这样获得的组织，无法实现长期培养、与体内比拟的功能性，因而不可作为一种有效的病理模型用于指导精确的药物评价，也难以预期可进行体内移植、并与原生组织融合。如图7(Bioengineered3Dplatformtoexplorecell-ECMinteractionsanddrugresistanceofepithelialovariancancercells.Biomaterials.2010Nov；31(32):8494-506)和图8(Coaxialbioprintingofcell-ladenvascularconstructsusingagelatin-tyraminebioink.BiomaterSci.2019Aug21)所示。也就是说，现有技术中缺乏快速制备血管化致密结构的体外组织的方法，用来克服现有技术中的上述缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提供一种细胞密度高、培养时间短的血管化组织构建方法。为了解决上述技术问题：本专利技术提供一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,包括如下步骤：(1)微孔板制备：制备微孔板，并对微孔板进行表面疏水处理；(2)内皮化细胞团簇生成：在微孔板中接种包含内皮细胞的异质细胞液，培养，得到内皮化细胞团簇；(3)3D打印：将生物墨水与步骤(2)中的内皮化细胞团簇混合，3D打印，得到内皮化的组织结构；(4)结构表面内皮涂附：将步骤(3)中的内皮化的组织结构表面进行胶原包被，在胶原表面铺设内皮细胞，完成内皮涂附，培养，得到血管化组织。其中,所述步骤(1)中，使用透氧型高分子聚合物，制备微孔板，包含但不限于如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、明胶、壳聚糖、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、丝素蛋白等，使用聚季铵盐进行表面处理。其中,所述步骤(2)中，培养时间为24h-48h，所述异质细胞液的接种密度与微孔板的尺寸正向相关，微孔板尺寸越大，对应的接种密度越大，但针对每种尺寸的微孔板，其最佳接种密度需要通过优化后，根据团簇成形效果最终确定。其中,所述步骤(2)中的异质细胞液包括：针对尺寸120μm的微孔板，欲形成内皮化的肝癌细胞团簇，经优化后的最佳接种条件为：内皮细胞与肝癌细胞以数量比1:1混合，异质细胞接种密度8×105cm-2(即内皮或肝癌细胞的接种密度分别为4×105cm-2)，培养基为两种细胞各自使用培养基的混合物(体积比1:1混合)。其中,所述步骤(3)中，所述生物墨水为包含或者不包含高密度分散的单个内皮细胞的材料体系，进行挤出式打印时，可使用的材料为明胶/海藻酸钠体系、明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原体系或者甲基丙烯酰化明胶(GelMA)；进行震荡式打印时，可使用的材料为海藻酸钠、纤维蛋白原或者GelMA。其中,所述步骤(3)中，所述生物墨水与内皮化细胞团簇的体积比为：5:5-7:3。其中,所述步骤(3)中，所述3D打印的打印方式为挤出式打印和震荡式打印。其中，所述震荡式打印是指：细胞喷射技术通过交变滞惯力驱动，即利用振动过程中粘性力和惯性力的交替作用实现含细胞微滴的制备，其中，振动过程通过压电陶瓷的受控形变来实现，并受波形发生器精确调控。通过改变输出波形的频率和振幅参数可方便地调节微滴的大小和体积，具有高度的一致性和可控性。该喷射打印技术不需高温高压条件，对细胞损伤小，细胞存活率可达到90％以上。同时，该技术还具有结构简单、微滴一致性好、定位精度高的优点。此外，通过调节喷嘴形状和悬浮液中的细胞密度可实现单细胞微滴的制备。其中，所述挤出式打印：采用注射器推挤的方式进行驱动，实现多种凝胶材料的挤出，构建较高细胞密度的体外组织结构。本专利技术的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法在制备血管化组织或者制备生物医疗材料中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的有益效果在于：1)能够得到多细胞共培养结构。团簇内细胞可以由两种或两种以上异质细胞组成(其中一种为内皮细胞)，结构中分散的高密度单细胞可以是内皮细胞(或内皮细胞与成纤维细胞两种细胞)，另外，结构外层可以涂附内皮细胞。2)包含内皮化的细胞团簇。微孔板中种入细胞时，异质细胞单细胞悬液中含有一定比例的内皮细胞，团簇生成时，可生成内皮化的细胞团簇。3)实现细胞精确定位。基于成像系统的实时打印，由于观测坐标系与机械坐标系的确定关系，可进一步得到目标点在机械坐标系中的位置。图像系统一方面提供了打印过程的实时观测和在线反馈，提高了细胞排列的可控性和精度；另一方面，细胞定位可根据凝胶中的微球分布实时确定，提供了一种不需预先路径规划的随形打印方式，提高细胞排列精度到100微米。4)得到高细胞密度的组织。通过微孔板技术可以得到致密团簇(细胞与细胞间紧密接触，聚集成团)；打印的结构中团簇体积占比高，紧密排布；组织结构内细胞密度高(～108/mL)，且细胞存活率可高达90％以上，细胞功能正常(细胞功能几乎不受影响，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,包括如下步骤：/n(1)微孔板制备：制备微孔板，并对微孔板进行表面疏水处理；/n(2)内皮化细胞团簇构建：在微孔板中接种包含内皮细胞的异质细胞液，培养，得到内皮化细胞团簇；/n(3)3D打印：将生物墨水与步骤(2)中的内皮化细胞团簇混合，3D打印，得到内皮化组织结构；/n(4)血管化组织的构建：将步骤(3)中的内皮化组织结构表面进行胶原包被，在胶原表面铺设人内皮细胞，完成内皮涂附，之后进行组织培养，得到血管化组织。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,包括如下步骤：
(1)微孔板制备：制备微孔板，并对微孔板进行表面疏水处理；
(2)内皮化细胞团簇构建：在微孔板中接种包含内皮细胞的异质细胞液，培养，得到内皮化细胞团簇；
(3)3D打印：将生物墨水与步骤(2)中的内皮化细胞团簇混合，3D打印，得到内皮化组织结构；
(4)血管化组织的构建：将步骤(3)中的内皮化组织结构表面进行胶原包被，在胶原表面铺设人内皮细胞，完成内皮涂附，之后进行组织培养，得到血管化组织。


2.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中，所述微孔板的表面疏水处理为：将微孔板进行氧等离子处理后在聚季铵盐溶液中浸泡，取出烘干，得到表面疏水的微孔板。


3.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中，所述微孔板为用于三维培养的商用微孔板，或者使用透氧型高分子聚合物制备的微孔板，包含但不限于如聚二甲基硅氧烷、明胶、壳聚糖、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、丝素蛋白等。


4.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中，培养时间为24h-48h，所述异质细胞液的接种密度与微孔板的尺寸正向相关。


5.根据权利要求1所述的基于细胞团簇直接3D打印的血管化组织构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞媛，周珍珍，孙伟，何剑宇，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11