人角质形成细胞的培养方法技术

本公开涉及培养人表皮角质形成细胞的方法。当在无异源物质的化学成分确定的细胞培养基中，将角质形成细胞在包被有包含α‑4链或α‑5链的层粘连蛋白的平板上培养时，角质形成细胞在体外有效扩增。本文还描述了用于培养角质形成细胞的有用的细胞培养试剂盒，以及使用此类细胞治疗烧伤或慢性创伤的方法。

Culture method of human keratinocytes

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人角质形成细胞的培养方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年5月5日提交的美国临时专利申请No.62/501,992的优先权，该申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
本公开涉及培养人表皮角质形成细胞的方法。这些角质形成细胞然后可以用于治疗，例如用于治疗严重烧伤、轻度烧伤和慢性创伤。这些经培养的细胞的其他潜在治疗应用可以是用于治疗人体内(例如眼睛、膀胱、口腔、肠等)的任何上皮损伤或病症，包括仅上皮受损的情况，或上皮下的成分也受损的情况。本文还公开了用于实施所述方法的试剂盒。非常普遍的情况是，角质形成细胞在层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质上培养，并暴露于无血清培养基以在不借助于饲养细胞的情况下支持角质形成细胞在体外存活。
技术介绍
烧伤仍然是一个巨大的临床问题，因为当超过40％总体表面积(TBSA)烧伤时，自体供区不足以提供用于创伤闭合的主要覆盖物。一种为克服这一问题而开发的技术是使用培养的上皮自体移植物(CEA)。该方法包括从小的皮肤活检组织分离并连续扩增皮肤表皮角质形成细胞，从而获得大量的培养上皮，以在3至4周内用于完全创伤覆盖。自从报告了用自体培养的人上皮永久覆盖大的烧伤创伤以来，这种技术已经在世界范围内成功地用于治疗严重烧伤，这通常是一种救生方法。目前用于培养人表皮角质形成细胞以进行严重烧伤治疗的黄金标准方案需要使用一些动物来源的产品(例如，牛血清和作为饲养细胞的小鼠3T3成纤维细胞)。这些产品不符合当今细胞治疗环境中常见的临床质量标准。小鼠细胞的存在带来了将人细胞培养物暴露于动物病原体和免疫原性试剂的风险。此外，培养基中使用的胎牛血清(FBS)是不确定的，并且具有批次之间的变化性。为了克服这个问题，已经开发了无血清和无异源物质的细胞培养基以用于角质形成细胞培养。然而，这些系统仍然不是最佳的，并且都没有被用于严重创伤缺陷的临床应用中。已经证明，与饲养细胞支持的角质形成细胞相比，在不使用经照射的3T3饲养细胞的情况下，使用无血清的角质形成细胞生长培养基培养角质形成细胞不能维持角质形成细胞的增殖能力。希望开发出一种在不借助于3T3饲养细胞和动物来源血清的情况下，支持角质形成细胞体外存活和扩增的方法。
技术实现思路
本公开提供了培养人表皮角质形成细胞的方法。这些角质形成细胞然后可以用于治疗，例如治疗和控制不太严重的烧伤和慢性创伤。更特别地，本公开还描述了一种用于以完全无异源物质的完全人源化的方法培养人表皮角质形成细胞的新系统。通过使用纯层粘连蛋白基质(例如LN-511和/或LN-421)和化学成分确定的无血清培养基，该方法支持角质形成细胞在体外存活，而无需借助于饲养细胞和异源成分，在成年患者细胞中有多达30次的群体倍增。在进一步的方面，本专利技术提供了用于培养角质形成细胞的试剂盒。FACS分析和免疫荧光染色证实了在该系统中生长的细胞表达角质形成细胞基底细胞标志物KRT5、KRT14、KRT15、ITGA6和ITGB1。分化标志物KRT1和KRT10在后面的传代中正常表达。在不同时间点进行的实时定量PCR分析(qPCR)显示了在不断增加的传代中角质形成细胞的基底细胞和分化谱。在一些方面，本公开描述了将角质形成细胞铺板于层粘连蛋白-411(LN-411)、层粘连蛋白-421(LN-421)、层粘连蛋白-511(LN-511)或层粘连蛋白-521(LN-521)的基质上，并使用细胞培养基培养所述细胞。换言之，基质中使用的层粘连蛋白包含α-4或α-5链。在特定的实施方案中，细胞培养基不含异源物质。在铺板前，细胞可以用胰蛋白酶EDTA传代。在特定方面，细胞培养基是基础培养基。根据一些实施方案，基础培养基包含胰岛素和化学成分确定的生长补充物。其他成分可以包括人表皮生长因子(hEGF)；氢化可的松；和抗生素和/或抗真菌剂，例如庆大霉素或两性霉素B。胰岛素可以是重组人胰岛素。在另外的实施方案中，基础培养基还包含肾上腺素和运铁蛋白。在一些实施方案中，可以将新鲜分离的角质形成细胞以约1x105/cm2的密度铺板于基质上。在特定的方面，角质形成细胞在含有约5％CO2至约15％CO2的气氛中培养。角质形成细胞可以在约30摄氏度至约40摄氏度的温度下培养。在其他实施方案中，角质形成细胞可以在约30摄氏度至约40摄氏度的温度下被胰蛋白酶消化。在具体的实施方案中，角质形成细胞被胰蛋白酶消化约4分钟至约12分钟。在更具体的实施方案中，角质形成细胞被胰蛋白酶消化约6分钟至约10分钟的时间。在进一步的具体实施方案中，角质形成细胞在达到约1x104细胞/cm2的密度时传代。本文还公开了一种用于维持角质形成细胞的系统，其包含含有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质以及细胞培养基。在具体的方面，所述细胞培养基不含异源物质。在其他方面，细胞培养基不含动物血清。本公开还描述了一种用于体外培养角质形成细胞的试剂盒。该试剂盒包括：具有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521包被层的细胞培养板；和细胞培养基，其中所述细胞培养基是无血清的。本文还公开了治疗患者烧伤创伤的方法。将取自患者供区的角质形成细胞铺板于包被有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质上。角质形成细胞在基质上扩增。然后使用来自基质的角质形成细胞覆盖烧伤创伤。本文还公开了治疗患者慢性创伤的方法。将取自患者供区的角质形成细胞铺板于包被有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质上。角质形成细胞在基质上扩增。然后使用来自基质的角质形成细胞覆盖创伤。本文还公开了治疗人体中任何损伤或病症的方法，包括仅上皮受损的情况，和/或上皮缺损是损伤的组成部分的情况。将取自患者供区的角质形成细胞铺板于包被有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质上。角质形成细胞在基质上扩增。然后，将来自基质的角质形成细胞用于覆盖上皮缺损。本文还公开了角质形成细胞用于治疗烧伤创伤、慢性创伤和其他上皮缺损的用途。期望的是，将角质形成细胞铺板于包被有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521的基质上，并使角质形成细胞在该基质上扩增。本公开的这些和其他非限制性特征将在下面更具体地公开。附图说明本专利或申请文件包含至少一个带有彩色的图。本专利或专利申请公开的带有彩图的副本将在请求和支付必要费用时由专利局提供。下面是附图的简要说明，其目的在于说明在此公开的示例性实施方案，而不是限制本专利技术。图1A-1J是在各种层粘连蛋白基质上培养的新鲜分离的人表皮角质形成细胞的一组图像，并且将其与不含层粘连蛋白的阴性对照基质以及将角质形成细胞与3T3成纤维细胞共培养的阳性对照基质进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增角质形成细胞的方法，包括：/n将角质形成细胞铺板于用含有α4链或α5链的层粘连蛋白包被的基质上。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170505 US 62/501,9921.一种扩增角质形成细胞的方法，包括：
将角质形成细胞铺板于用含有α4链或α5链的层粘连蛋白包被的基质上。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有α4链或α5链的层粘连蛋白是层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521中的至少一者。


3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在无异源物质的细胞培养基中培养角质形成细胞。


4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将新鲜分离的角质形成细胞铺板于所述基质上。


5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将所述角质形成细胞以约0.7x105/cm2至约1.2x105/cm2的密度铺板于所述基质上。


6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在约30℃至约40℃的温度下在所述基质上培养所述角质形成细胞。


7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在含有约5％CO2至约15％CO2的气氛中培养所述角质形成细胞。


8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括周期性地解离和传代所述角质形成细胞。


9.根据权利要求8所述的方法，其中在细胞密度达到1细胞/cm2至约1.5x104细胞/cm2时发生所述角质形成细胞的传代。


10.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质包被有层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-421。


11.根据权利要求10所述的方法，其中层粘连蛋白-511与层粘连蛋白-421的重量比为15:1至1:15。


12.一种用于扩增角质形成细胞的系统，包括：
含有层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521的基质；以及
细胞培养基。

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔·特吕格瓦松，莫里卡·苏里亚那·特金，蔡文忠，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，新加坡保健服务集团有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG