本发明专利技术涉及细胞模型技术领域，具体是一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，是将肝实质细胞和/或肝非实质细胞通过肝细胞转化增殖培养基诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞。本发明专利技术通过运用谱系示踪的方法，分离小鼠肝脏中的实质与非实质细胞，通过体外小分子组合诱导培养，二者均成功转化为具有增殖再生功能的肝前体样细胞，同时通过三维培养及类器官培养后证明，二者均保持了其细胞来源的特性。本发明专利技术有助于进一步研究不同来源肝前体细胞生物学形态学特性，深入探索其作为新的移植细胞来源的应用前景。
Preparation and application of a liver precursor like cell from different sources
【技术实现步骤摘要】
一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用
本专利技术涉及细胞模型
，具体地说，是一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
今年研究表明，谱系示踪模型通过特定的荧光信号标记细胞，在肝脏处于不同的状态下研究其来源，演化及最终去向(Tarlow,B.D.,C.Pelz,W.E.Naugler,L.Wakefield,E.M.Wilson,M.J.Finegold,andM.Grompe,Bipotentialadultliverprogenitorsarederivedfromchronicallyinjuredmaturehepatocytes.CellStemCell,2014.15(5):p.605-18.)。其全程可视化的优势使其备受各研究团队的青睐。在肝再生研究领域中，近年来众多研究通过对不同细胞表面标记物示踪，发现当肝脏处于慢性损伤状态，其实质细胞及非实质细胞均有可能转化为肝前体细胞，当通过流式细胞术利用荧光标记分离不同来源的肝前体细胞，发现其在体外培养中均具备肝向及胆向分化的潜能，然而由于体内内源性肝前体细胞数量极少的这一天然阻碍，对不同来源的肝前体细胞进行深入细胞学特性及功能探索仍相当受限。另外，近年研究表明，体外通过应用不同小分子组合配比，可有效对肝实质细胞及非实质细胞进行三维培养及类器官(Organoid)培养，并在培养过程中，可长时间较稳定维持细胞特性(Hu,H.,H.Gehart,B.Artegiani,L.O.-I.C,F.Dekkers,O.Basak,J.vanEs,S.M.ChuvadeSousaLopes,H.Begthel,J.Korving,M.vandenBorn,C.Zou,C.Quirk,L.Chiriboga,C.M.Rice,S.Ma,A.Rios,P.J.Peters,Y.P.deJong,andH.Clevers,Long-TermExpansionofFunctionalMouseandHumanHepatocytesas3DOrganoids.Cell,2018.175(6):p.1591-1606e19.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用。本专利技术通过运用肝细胞转化增殖培养基(TransitionandExpansionMedium，TEM)，经过一定时间诱导培养后，将肝实质细胞(hepatocytes)及非实质细胞(non-parenchymal-cell,NPC)转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞(分别为HepLPCs及NPC-LPCs)，并在体外联合三维培养及类器官(Organoid)培养验证其功能特性。本专利技术的第一方面，提供一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，是将肝实质细胞(hepatocytes)和/或肝非实质细胞(non-parenchymal-cell,NPC)通过肝细胞转化增殖培养基(TEM)诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞(称为HepLPCs和/或NPC-LPCs)。进一步的，所述的不同来源肝前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：(A)分离获得来自小鼠肝脏的原代实质细胞和/或非实质细胞后，将细胞以2×104/cm2的密度种到经胶原包被过的培养皿中，用肝细胞转化增殖培养基(TEM)培养基培养；(B)细胞在1周后可基本长满，然后将细胞用少许Accutase消化酶消化，将细胞置于37℃孵箱中孵育3～5分钟后(消化的具体时间视细胞状态而定)，轻轻拍打培养皿可见细胞在消化液中如泥沙样漂浮，往培养皿中加入体积为消化液1倍的含有血清的完全培养基去终止消化，将培养皿中的培养基用吸引器吸走后，之后用移液管轻轻吹打细胞后吸入玻璃离心管内，900转速、3分钟离心，吸走上清，以1：2的比例传代；当细胞进入倍增时间为15-20小时的指数扩增时，获得可以以稳定的增长速度进行增殖传代的肝前体样细胞。更进一步的，所述的肝细胞转化增殖培养基(TEM)是在DMEM/F12培养基基础上，添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5～1.5mmol/L丙酮酸钠、5～50μg/mL抗坏血酸维生素C、5～25ng/mL肝细胞生长因子HGF、5～25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5～20μmol/LROCK激酶抑制剂Y27632、1～5μmol/LWnt信号通路激动剂CHIR99021。本专利技术的第二方面，提供一种不同来源肝前体样细胞，其采用如上所述的制备方法制备得到。本专利技术的第三方面，提供一种如上所述的肝前体样细胞的三维培养及类器官培养方法，包括以下步骤：三维培养：2mL肝细胞转化增殖培养基(TEM)重悬约1×106肝前体样细胞，种植于低粘附6孔板中1孔，同时置于细胞培养CO2孵箱内摇床上培养；6小时后细胞逐渐凝聚成球状，2-3天加入0.5mL肝细胞转化增殖培养基(TEM)继续培养5-7天；类器官三维培养：肝前体样细胞以2×104/mL浓度重悬于50％浓度的matrigel中，移入24孔板的一个角落里，常温下放置2小时使matrigel凝固，再加入500uL肝细胞转化增殖培养基(TEM)继续培养5-7天。本专利技术的第四方面，提供肝细胞转化增殖培养基(TEM)在制备肝前体样细胞中的应用，所述的肝前体样细胞的来源为肝实质细胞或肝非实质细胞。本专利技术的第五方面，提供肝细胞转化增殖培养基(TEM)在制备功能肝细胞中的应用，所述的功能肝细胞的来源为肝实质细胞或肝非实质细胞。本专利技术优点在于：1、本专利技术通过运用谱系示踪的方法，分离小鼠肝脏中的实质与非实质细胞，通过体外小分子组合诱导培养，二者均成功转化为具有增殖再生功能的肝前体样细胞，同时通过三维培养及类器官(organoid)培养后证明，二者均保持了其细胞来源的特性。2、本专利技术利用TEM体系扩增不同来源的肝前体细胞达到足够的数量后，有助于进一步研究不同来源肝前体细胞生物学形态学特性，深入探索其作为新的移植细胞来源的应用前景。附图说明图1：两种示踪小鼠模型的构建方法、荧光显微镜下肝脏组织切片图、流式分选结果及经过TEM培养基诱导培养后的肝前体样细胞的光镜及荧光显微镜下图。图2：HepLPCs和NPC-LPCs增殖速度差异。A、B、C图分别为HepLPCs和NPC-LPCs的增殖速度、第5代和10代的倍增时间以及两代次的edu荧光染色情况；其中A图显示HepLPCs和NPC-LPCs具有相似的增殖的速度，B、C图显示二者的不同代次具有相似的倍增速度。图3：HepLPCs和NPC-LPCs在肝脏功能相关及前体(胆管上皮细胞)标志物的差异表达。A、B图为HepLPCs和NPC-LPCs在肝脏功能相关及前体(胆管上皮细胞)标志物的转录水平表达；图C为HepLPCs和NPC-LPCs肝脏功能相关及前体标志物的免疫荧光表达情况。图4：HepLPCs和NPC-LPCs在Organoid类器官及三维肝球培养中的差异。A图为HepLPCs本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，是将肝实质细胞和/或肝非实质细胞通过肝细胞转化增殖培养基诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞。/n
【技术特征摘要】
1.一种不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，是将肝实质细胞和/或肝非实质细胞通过肝细胞转化增殖培养基诱导培养后，转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞。
2.根据权利要求1所述的不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)分离获得来自小鼠肝脏的原代实质细胞和/或非实质细胞后，将细胞以2×104/cm2的密度种到经胶原包被过的培养皿中，用肝细胞转化增殖培养基(TEM)培养基培养；
(B)细胞在1周后可基本长满，然后将细胞用少许Accutase消化酶消化，将细胞置于37℃孵箱中孵育3～5分钟后，轻轻拍打培养皿可见细胞在消化液中如泥沙样漂浮，往培养皿中加入体积为消化液1倍的含有血清的完全培养基去终止消化，将培养皿中的培养基用吸引器吸走后，之后用移液管轻轻吹打细胞后吸入玻璃离心管内，900转速、3分钟离心，吸走上清，以1：2的比例传代；当细胞进入倍增时间为15-20小时的指数扩增时，获得可以以稳定的增长速度进行增殖传代的肝前体样细胞。
3.根据权利要求1所述的不同来源肝前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述的肝细胞转化增殖培养基是在DMEM/F12培养基基础上，添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5～1.5mmol/L丙酮酸钠、5...
【专利技术属性】
技术研发人员：鄢和新，黄伟健，王红阳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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