一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗，所述细胞株为CHOK1‑DC005细胞株，保藏号为CGMCC No.16211。本发明专利技术使得新城疫疫苗实现了由鸡胚向哺乳动物细胞大规模培养生产的转变，这不仅简化了新城疫疫苗的生产工艺，降低生产成本，还大大提高疫苗的产量和质量。

A Newcastle disease virus / suspension chok1 cell line and its preparation, antigens and vaccines prepared by the cell line

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗
本专利技术涉及CHOK1细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用，属于兽用生物制药领域，具体地，本专利技术涉及一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株及其制法和采用该细胞株制备的抗原及疫苗。
技术介绍
目前，国内禽用疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。虽然这种技术也不断进化来应对各种挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生产速度等方面。但在我国实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。尤其是禽用弱毒疫苗的制备，若所用鸡胚来自普通鸡蛋，可造成外源病原的污染，并由此造成了某些疫病的传播和蔓延。与此同时，鸡胚中的母源抗体还会干扰接种疫苗病毒的繁殖，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株。本专利技术的另一目的在于，提供一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株的制备方法。本专利技术的再一目的在于，提供一种新城疫病毒抗原的制备方法以及采用所得到的抗原制备新城疫疫苗。本专利技术利用悬浮培养的CHOK1细胞进行新城疫疫苗的生产，不仅缩短了疫苗生产周期，降低劳动强度和生产成本，还减少批间差异提高了疫苗质量，悬浮CHOK1细胞在新城疫疫苗上的应用，有望终结新城疫疫苗的鸡胚时代。为达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，所述细胞株为CHOK1-DC005细胞株，保藏号为CGMCCNo.16211，为中国仓鼠卵巢细胞。一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将适合新城疫病毒侵染的CHOK1细胞通过全悬浮驯化与筛选最终获得新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株。一种新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)复苏上述新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，并采用悬浮细胞培养瓶逐级放大，将细胞扩增，待细胞生长至浓度为不低于6×106cells/mL后，全部转移至生物反应器中，培养并采样进行细胞计数和活力检测；2)接毒和收毒当生物反应器中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％-5％比例接入新城疫病毒，于接毒后24h起，每隔一时间段采样进行细胞计数，当活细胞密度低于0.5×106后，收获病毒液即为新城疫病毒抗原，效价HA滴度达10-12log2/100μL。优选地，所述新城疫病毒的病毒株为新城疫病毒Ⅰ系疫苗株、新城疫病毒Ⅱ系疫苗株、新城疫病毒Ⅲ系疫苗株、新城疫病毒Ⅳ系疫苗株、新城疫病毒克隆-30疫苗株或新城疫病毒基因Ⅶ型疫苗株。一种新城疫疫苗，所述疫苗采上述制备的新城疫病毒抗原制备得到。一种新城疫疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将收获的新城疫病毒抗原用甲醛灭活；2)向灭活后的新城疫病毒抗原加入水相混匀，与油相混合乳化分散均匀即得新城疫疫苗。具体地，本专利技术新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)病毒株的选择：病毒株的选择为新城疫病毒为Ⅰ系、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)、克隆-30、基因Ⅶ型等疫苗株；2)悬浮细胞株的驯化：将适合新城疫病毒培养用的CHOK1细胞进行全悬浮驯化和连续克隆纯化，获得新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株；3)悬浮细胞扩大培养：复苏新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，采用悬浮细胞培养瓶逐级放大为总体积为1升的悬浮培养液，待细胞浓度达到6×106细胞/mL后，全部转移至赛多利斯A总体积为5L的生物反应器中，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH7.2，溶氧40％，分别于培养24h、48h采样进行细胞计数和活力检测；4)接毒和收毒：当赛多利斯A中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％比例接入新城疫病毒，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和二氧化碳，转速200r/min，温度37℃，pH7.4，溶氧40％，于接毒后24h起，每隔2h采样进行细胞计数，活细胞密度低于0.5×106细胞/mL后，收获病毒液即为抗原，效价HA滴度可以达到10-12(log2/100μL)。本专利技术用于制备抗原所用到的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株，优选地，所述新城疫病毒的病毒株为新城疫病毒Ⅰ系疫苗株、新城疫病毒Ⅱ系疫苗株、新城疫病毒Ⅲ系疫苗株、新城疫病毒Ⅳ系疫苗株、新城疫病毒克隆-30疫苗株或新城疫病毒基因Ⅶ型疫苗株。一种新城疫疫苗的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：1.病毒株的选择1)病毒株的选择为新城疫病毒为Ⅰ系、Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(Lasota株)、克隆-30、基因Ⅶ型等疫苗株。2.毒种库的建立(以Lasota株为例)1)将鸡胚放在灭菌的蛋盘中，在温度36.0-39.0℃，湿度45-65％培养；2)将鸡胚接种之前用碘酒和酒精消毒，PBS将病毒稀释104-105倍；用锥子给鸡胚打孔，尿囊腔接种病毒量为0.1mL/枚；3)将鸡胚封口，将接种后鸡胚置于36.0-39.0℃的孵化箱中培养；4)接种后，每天观察鸡胚的死亡情况，将第一天死亡的鸡胚放入生物垃圾桶弃掉；5)选接种72h-120h死亡的且病痕明显的鸡胚，置于4℃中冷却4-24h；6)将鸡胚表面消毒，打开气室表面的蛋壳；打开壳膜，收获鸡胚液(尿囊液及羊水)收获于灭菌的容器中，将病毒分装于1.5mL的EP管中储存于-65(-75)℃中备用；7)收获的E4代前基础种毒，用PBS稀释105倍后，混匀，分装于1.5mL无菌EP管中，储存于-65(-75)℃冰箱中作为基础种毒库；8)工作种毒库是在基础毒库的基础上对病毒进行传代，收获病毒液，混匀后分装于无菌的EP管中，记录病毒的详细信息(包括代次，数量等)，储存于-65(-75)℃冰箱中作为工作种毒库。3.悬浮细胞株的驯化(1)全悬浮CHOK1细胞的筛选与克隆；具体方法为：1)利用含2-8％血清的培养基在37℃，5％CO2单层贴壁培养适合新城疫病毒培养用CHOK1细胞，收集培养上清中贴壁能力弱或不贴壁的散在细胞；2)在37℃，5％CO2条件下悬浮培养收集的细胞，悬浮培养的CHOK1细胞经1000r/min离心15min，弃上清，重悬细胞沉淀；3)细胞沉淀重悬后经培养基适当稀释，利用微量细胞板对收集的CHOK1细胞进行连续单克隆化培养，筛选出不贴壁生长的单细胞克隆株。(2)全悬浮CHOK1细胞的放大和种子批建立；具体方法为：1)利用低血清或无血清培养基将CHOK1细胞克隆株用摇瓶悬浮培养放大，得到适应低血清或无血清全悬浮培养的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，其特征在于，所述细胞株为CHOK1-DC005细胞株，保藏号为CGMCC No.16211。/n

【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，其特征在于，所述细胞株为CHOK1-DC005细胞株，保藏号为CGMCCNo.16211。


2.权利要求1所述新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将适合新城疫病毒侵染的CHOK1细胞通过全悬浮驯化与筛选最终获得新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株。


3.一种新城疫病毒抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)复苏权利要求1所述新城疫病毒/全悬浮CHOK1细胞株，并采用悬浮细胞培养瓶逐级放大，将细胞扩增，待细胞生长至浓度为不低于6×106cells/mL后，全部转移至生物反应器中，培养并采样进行细胞计数和活力检测；
2)接毒和收毒
当生物反应器中活细胞密度不低于2.5×106细胞/mL，按细胞培养液体积的1％-5％比例接...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯野，李燕，王璐，韩丹，宋春雨，邵瑞华，刘少奇，李俊锋，李凤友，
申请(专利权)人：北京鼎持生物技术有限公司，辽宁鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11