本发明专利技术涉及一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法。利用猪丹毒SpaA蛋白免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别SpaA蛋白，基于该单克隆抗体经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，可用于猪丹毒SpaA蛋白的定量，检测最低浓度可达到0.1ng/ml，灵敏度高，相关系数R2为0.993，定量准确性好，可应用于猪丹毒SpaA蛋白的定量检测，该方法的建立克服了目前传统定量方法中存在的无法区分杂蛋白与目的蛋白的情况，从而保证定量数据的精确性，提高疫苗工艺的稳定性与严谨性。与严谨性。与严谨性。
【技术实现步骤摘要】
一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法
[0001]本专利技术涉及一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒、检测方法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。
技术介绍
[0002]猪丹毒(Swineerysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrixrhμsiopathiae)引起的一种急性、热性传染病，其临诊特征主要为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。该病广泛流行于世界各地，包括我国许多地区，几十年前的三大传染病就包括猪丹毒。给养猪产业带来了相当大的经济损失。
[0003]猪丹毒丝菌在自然环境中广泛存在，最主要传染源是患病猪，通过粪便、尿液或口腔分泌物传播，在被污染饲料、饮水、土壤和圈舍等存在，并能在土壤中生存和繁殖，耐环境性强。各种日龄、品种和性别的猪均可以引起感染，主要是3
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6月龄猪只最容易出现发病。温度、湿度营养、疲劳等因素都能诱发该病。猪丹毒全年多发，在夏季高温或者温度突变时易发，所有日龄猪均可感染，特别是成年猪更易感，给猪场带来严重的损失，猪丹毒的潜伏期最短1天，最长可达7日以上此外，也有哺乳动物、禽类、鱼类和两栖类等动物感染猪丹毒的报道。同时红斑丹毒丝菌也是一种重要的人畜共患菌，可导致人类感染，人感染红斑丹毒丝菌叫做类丹毒。
[0004]随着抗生素滥用问题的突出，临床上出现大量的耐药菌，因此采用疫苗免疫是预防猪丹毒等细菌病的最有效的方式。猪丹毒疫苗的研究涉及灭活苗，活疫苗，亚单位疫苗和载体疫苗等；目前市场上主要使用传统疫苗，即猪丹毒灭活菌苗和弱毒活菌苗。其主要问题在于弱毒菌株存在毒力返强，全菌灭活疫苗中存在大量无效成份，既可引起严重的副反应，又会引起过多无意义的非特异性免疫应答，浪费机体的免疫潜力问题。因此，研制新型疫苗是猪丹毒疫苗研究的主要方向，已报道的猪丹毒新型疫苗研究主要包括亚单位疫苗和乳酸菌载体疫苗等。
[0005]亚单位疫苗是通过化学分解、蛋白合成或表达等方法，获得细菌和病毒具有免疫功能的蛋白结构，从而筛选到一类不含核酸的基因工程疫苗。亚单位疫苗的抗原仅有少数几种蛋白，因此可以避免过多无关抗原对机体进行无效的免疫刺激，从而节约机体的免疫潜力，同时减少疫苗的副反应。
[0006]目前关于猪丹毒的抗原蛋白定量方法停留在BCA、bradford等方法，这些定量方法都局限于不能区分杂蛋白与抗原蛋白，导致其最终的定量数据差异极大，从而影响抗原半定量的结果。最终影响疫苗的效力，因此急需建立一种可靠的和可重复的定量分析方法用于疫苗生产过程中的抗原定量及疫苗抗原有效成分的定量分析。为了保证分析的可靠性，必须充分验证定量方法。主要考虑一下几点：特异性，保证样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物；灵敏度，标准曲线和定量范围，应提供标准曲线的线性方程和相关系数；精密度，用质控样品的批内和批间变异系数(CV)来考察方法的精确
度；准确度，在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于：将猪丹毒SpaA作为免疫原采用多次免疫方式制备单克隆抗体，该单抗在WesternBlot中能识别目的蛋白，在建立的双抗夹心ELISA体系中，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪丹毒SpaA蛋白，最低检测下限为0.1ng/mL，为后续疫苗的准确定量及质量控制提供基础。
[0008]本专利技术首先提供了一种猪丹毒SpaA双抗体夹心定量ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板、稀释液、封闭液、酶标抗体、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照，所述包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板使用的是单抗16H7，所述单抗16H7由小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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16H7株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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16H7株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45611。
[0009]进一步的，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗猪丹毒SpaA单克隆抗体，所述抗猪丹毒SpaA单克隆抗体为单抗24G12，所述单抗24G12由小鼠杂交瘤细胞24G12株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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24G12株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45612。
[0010]进一步的，所述稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液，PH值为9.6，含有1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3。
[0011]进一步的，所述封闭液为含5％脱脂乳的PBS溶液。
[0012]同专利技术同时还提供了一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0013](1)用包被液稀释纯化后的单抗16H7，按照100μl/孔包被酶标板，37℃包被2h或者4℃作用过夜；
[0014](2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入封闭液，100μl/孔，置37℃孵育1.5h；
[0015](3)用洗涤液洗板5次，加入一定稀释度的待检抗原样品及对照样品，100μl/孔，置37℃孵育，同时设不加抗原对照(用脱脂乳代替)；
[0016](4)用洗涤液洗板5次，加入稀释的酶标抗体24G12
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HRP，100μl/孔，置37℃孵育1h；(5)用洗涤液洗板5次，加入TMB，50μl/孔，室温显色15min；
[0017](6)加终止液，50μl/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
[0018]进一步的，所述步骤(1)中包被液按照1:1000稀释单抗16H7，所述步骤(4)中酶标抗体按照1:2000稀释。
[0019]相对于现有技术，本专利技术提供的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法的进步之处在于，利用猪丹毒SpaA抗原蛋白免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别猪丹毒SpaA蛋白，可用于WB、IFA等猪丹毒相关检测；进行抗体配对筛选后，经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪丹毒SpaA蛋白，最低检测下限为0.1ng/mL，为后续疫苗的准确定量及质量控制提供基础。
附图说明
[0020]图1为猪丹毒SpaAWB检测图，图中标记1：maker；2：BSA
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2mg/ml；3：BSA
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1mg/ml；4：BSA
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0.5mg/ml；5：BSA
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0.25mg/ml；6：BSA
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0.125mg/ml。
[0021]图2为猪丹毒SpaASDS定量图，图中标记1：maker；2：BSA
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板、稀释液、封闭液、酶标抗体、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照，所述包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板使用的是单抗16H7，所述单抗16H7由小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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16H7株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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16H7株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45611。2.根据权利要求1所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗猪丹毒SpaA单克隆抗体，所述抗猪丹毒SpaA单克隆抗体为单抗24G12，所述单抗24G12由小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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24G12株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)
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24G12株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45612。3.根据权利要求1所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液，PH值为9.6，含有1.59g的Na2CO3、2.93g的Na...
【专利技术属性】
技术研发人员：周佳彬，刘喜凤，张菁怡，王浩宇，仲鑫，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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