一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法。本发明专利技术采用普鲁士蓝(PB)修饰四氧化三铁，再用壳聚糖碳点包覆，形成具有强拟过氧化酶带正电荷的纳米材料(Fe3O4/PB@CS

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法


[0001]本专利技术涉及化学分析检测
，具体为一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法。

技术介绍

[0002]随着食源性疾病发病率的显著增加，食源性疾病已成为世界性的重大公共卫生问题。食源性疾病的大量暴发可追溯到食用被致病菌污染的食品。致病菌又称病原微生物，食源性致病菌的检测对于防止其危害具有重要意义，其中用于各种各样基于适配体的生物传感器的研究已有相关报道。核酸适配体是通过指数富集配体进化系统(Systematicevolutionof ligandsbyexponentialenrichment，SELEX)筛选出的单链DNA或者RNA序列，可与目标配体高亲和力、高特异性结合，具有易合成和修饰、稳定性和重现性好、灵敏度高等特点。
[0003]纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用，让纳米酶具有更大的应用前景。四氧化三铁具有过氧化氢纳米模拟酶特性早已得到证实，但由于酶活低、纳米粒子易团聚等缺陷使其应用受到限制。
[0004]本专利技术采用普鲁士蓝(PB)修饰四氧化三铁，不仅增大催化剂的表面积，提高了Fe3O4纳米粒子的分散性，从而有效提高纳米酶活性，再用壳聚糖碳点包覆，形成具有强拟过氧化酶的带正电荷的复合纳米材料(Fe3O4/PB@CS
‑
CDs)，由于表面带正电纳米酶与大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)具有的强亲和力，Fe3O4/PB@CS
‑
CDs氧化3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)时，大肠杆菌和沙门氏菌与相应适配体复合物分别选择性抑制了该氧化反应进行，大肠杆菌和沙门氏菌浓度与氧化TMB吸光度降低呈线性关系，建立高灵敏、选择性强大肠杆菌和沙门氏菌检测新方法，检出限为10CFU/mL，检测时间仅需要35min。将本方法应用于食品中大肠杆菌和沙门氏菌的检测分析，结果与GB4789.3
‑
2016食品安全国家标准食品微生物学检验
‑
大肠菌群计数及GB4789.4
‑
2016食品安全国家标准食品微生物学检验
‑
沙门氏菌检验测定方法相符。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法，利用致病菌适配体复合物抑制TMB氧化的效果，建立大肠杆菌和沙门氏菌检测新方法。
[0006]一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
[0007](1)大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)适配体分别与普鲁士蓝(PB)修饰
四氧化三铁包覆壳聚糖碳点纳米酶Fe3O4/PB@CS
‑
CDs在37℃恒温箱中孵育25
‑
30min，制得纳米酶与适配体复合物；
[0008](2)分别在不同梯度浓度的E.coli及Salmonella中加入纳米酶与适配体复合物溶液，然后加入3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)溶液及H2O2，生成蓝色oxTMB，用pH5醋酸盐缓冲溶液定容至5mL，摇匀，静置5
‑
10min，磁铁分离油酸包覆四氧化三铁，取上清液，测定吸光度，确定E.coli及Salmonella浓度与吸光度A的线性关系；
[0009](3)取含E.coli及Salmonella的待测样品液分别与纳米酶与适配体复合物溶液、TMB及H2O2溶液反应，紫外光度计进行吸光度检测，根据吸光度计算待测样品液中E.coli及Salmonella浓度。
[0010]所述的Fe3O4/PB@CS
‑
CDs的制备如下：
[0011](1)将1.5
‑
1.8g硫酸亚铁铵和1.4
‑
1.5g三氯化铁溶于40
‑
60mL去离子水中，将混合液转移至250mL三口烧瓶中，氮气保护下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5mL氨水(w/v，28％)，80℃搅拌30min后，冷却至室温，将形成的沉淀(Fe3O4)用去离子水洗涤4
‑
5次以去除残留离子，真空干燥，得Fe3O4；在10mg/mLFe3O430
‑
40mL溶液中加入0.7
‑
1.0g亚铁氰化钾和0.3
‑
0.4g铁氰化钾，搅拌30
‑
40min使其充分混匀；缓慢加入0.5mol/L的HCl20
‑
25mL，溶液由棕色转变为绿色，继续搅拌40
‑
60min，溶液呈现蓝色，用钕铁硼(Nd
‑
Fe
‑
B)强磁性磁铁分离，并用去离子水洗涤数次至上清液呈无色，真空干燥，即得Fe3O4/PB；
[0012](2)将1.0
‑
2.0g壳聚糖溶于50mL(w/v，1％)醋酸溶液，转移到100mL聚四氟乙烯内胆中，于180
‑
200℃恒温加热8
‑
10h，反应完成后自然冷却至室温，将溶液用0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，再经高速离心，上清液真空干燥，得到壳聚糖碳点CS
‑
CDs；
[0013](3)将50
‑
100mgFe3O4/PB分散于40
‑
60mL0.1mg/mL的CS
‑
CDs溶液中，搅拌5
‑
8h，得到Fe3O4/PB@CS
‑
CDs。
[0014]所述的E.coli适配体序列为：GCAATGGTACGGTACTTCCCCATGAGTGTTGTGAAATGTTGGGACACTAGGTGGCATA GAGCCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA；Salmonella适配体序列为：CTGATGTGTGGGTAGGTGTCGTTGATTTCTTCTGGTGGGG。
[0015]所述的E.coli及Salmonella溶液的浓度为101‑
104CFU/mL；Fe3O4/PB@CS
‑
CDs与适配体溶液的体积比为8
‑
10：1；Fe3O4/PB@CS
‑
CDs溶液浓度为1.0mg/mL，适配体浓度为0.25μmol/L，TMB浓度为10mmol/L，体积100
‑
200μL，H2O2浓度为20mmol/L，体积为100
‑
200μL。
[0016]所述的离心是在8000
‑
10000r/min下处理10
‑
15min。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米酶结合适配体快速检测食品中大肠杆菌和沙门氏菌的方法，包括以下步骤：(1)大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)适配体分别与普鲁士蓝(PB)修饰四氧化三铁包覆壳聚糖碳点纳米酶Fe3O4/PB@CS
‑
CDs在37℃恒温箱中孵育25
‑
30min，制得纳米酶与适配体复合物；(2)分别在不同梯度浓度的E.coli及Salmonella中加入纳米酶与适配体复合物溶液，然后加入3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)溶液及H2O2，生成蓝色oxTMB，用pH5醋酸盐缓冲溶液定容至5mL，摇匀，静置5
‑
10min，磁铁分离油酸包覆四氧化三铁，取上清液，测定吸光度，确定E.coli及Salmonella浓度与吸光度A的线性关系；(3)取含E.coli及Salmonella的待测样品液分别与纳米酶与适配体复合物溶液、TMB及H2O2溶液反应，磁铁分离，紫外光度计进行吸光度检测，根据吸光度计算待测样品液中E.coli及Salmonella浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Fe3O4/PB@CS
‑
CDs的制备如下：(1)将1.5
‑
1.8g硫酸亚铁铵和1.4
‑
1.5g三氯化铁溶于40
‑
60mL去离子水中，将混合液转移至250mL三口烧瓶中，氮气保护下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5mL氨水(w/v，28％)，80℃搅拌30min后，冷却至室温，将形成的沉淀(Fe3O4)用去离子水洗涤4
‑
5次以去除残留离子，真空干燥，得Fe3O4；在10mg/mLFe3O430
‑
40mL溶液中加入0.7
‑
1.0g亚铁氰化钾和0.3
‑
0.4g铁氰化钾，搅拌30
‑
40min使其充分混匀；缓慢加入0.5mol/L的HCl20
‑
25mL，溶液由棕色转变为绿色，继续搅拌40
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨亚玲，李秋兰，杨德志，
申请(专利权)人：云南伦扬科技有限公司，
类型：发明
国别省市：