检测猪盖塔病毒的间接ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测猪盖塔病毒的间接ELISA试剂盒。所述试剂盒包括包被抗原，所述包被抗原可为猪盖塔病毒E2蛋白。所述E2蛋白的氨基酸序列可为序列表中序列4。实验证明，本发明专利技术所建立的间接ELISA试剂盒特异性较高，与CSFV、PRRSV等无交叉反应，重复性良好，灵敏度高，使用稀释倍数为1：640的猪盖塔病毒阳性血清仍能准确检测出阳性，与金标准检测方法相比总符合率为96.7％。该方法便于规模化应用，可作为目前GETV血清学检测及疫苗评价的可靠选择。前GETV血清学检测及疫苗评价的可靠选择。

【技术实现步骤摘要】
检测猪盖塔病毒的间接ELISA试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及检测猪盖塔病毒的间接ELISA试剂盒。

技术介绍

[0002]盖塔病毒(Getah virus,GETV)属于披膜病毒科甲病毒属，主要通过各种蚊子传播。目前GETV已经在亚洲，澳大利亚和欧亚地区广泛分布，并且已在人类、猴子、鸟类、猪、马及其他哺乳动物中发现GETV感染。近年来，盖塔病毒在动物中多次暴发。研究表明GETV宿主范围在不断扩大并且有扩散的可能。因此，对GETV及其相关疾病的监测对于控制病毒传播至关重要。
[0003]GETV血清学诊断主要基于病毒中和实验、血凝素抑制实验和补体固定试验。这些检测方法由于涉及到抗原制备和血清样品处理等，操作复杂，效果均不理想。已有研究用E2原核表达建立ELISA方法，但存在E2蛋白表达量不高、溶解性不好等问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何制备检测猪盖塔病毒的试剂盒或如何检测猪盖塔病毒。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了检测猪盖塔病毒的试剂盒。所述试剂盒包括包被抗原。所述包被抗原可为E2蛋白。所述E2蛋白可为如下的蛋白质：
[0006]A1)氨基酸序列是序列表中序列4的第7
‑
406位氨基酸残基；
[0007]A2)氨基酸序列是序列表中序列4；
[0008]A3)将A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/
[0009]或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2) 所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0010]A4)在A1)或A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0011]上文所述试剂盒可为酶联免疫试剂盒。
[0012]上文所述试剂盒可为间接酶联免疫(间接ELISA)试剂盒。
[0013]上文所述试剂盒还可包括酶标二抗抗体。
[0014]上文所述试剂盒中，所述酶标二抗抗体可为HRP标记的山羊抗猪抗体。
[0015]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了制备上文所述的试剂盒的方法。所述方法可包括将上文所述的E2蛋白包被于ELISA包被板的步骤。所述包被条件可为37℃包被两小时。
[0016]上文所述试剂盒的使用方法可包括如下步骤：在上文所述试剂盒中加入待测血清，37℃孵育1h，用PBST洗涤；加入1：3000稀释的所述酶标二抗，37℃孵育60min，用PBST洗涤；加入显色液显色15min。
[0017]上文所述酶标二抗可为HRP标记山羊抗猪抗体。所述显色液可为TMB。
[0018]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了与上文所述的E2蛋白相关的生物材料的
下述任一种应用：
[0019]Q1、所述生物材料在制备检测检测猪盖塔病毒的产品中的应用。
[0020]Q2、所述生物材料在制备检测或诊断猪盖塔病毒所致疾病的产品中的应用。
[0021]Q3、所述生物材料在制备或开发猪盖塔病毒所致疾病的治疗性抗体中的应用。
[0022]Q4、所述生物材料在制备或开发猪盖塔病毒所致疾病的药物中的应用。
[0023]Q5、所述生物材料在鉴定或检测猪盖塔病毒疫苗有效性中的应用。
[0024]所述生物材料可为下述D1)至D4)中的任一种：
[0025]D1)编码上文所述E2蛋白的核酸分子。
[0026]D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒。
[0027]D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体。
[0028]D4)含有D1)所述核酸分子的重组细胞系、或含有D2)所述表达盒的重组细胞系、或含有D3)所述重组载体的重组细胞系。
[0029]上文所述应用中，D1)所述核酸分子可为如下d1)、d2)或d3)所示的所述蛋白质的编码基因：
[0030]d1)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子。
[0031]d2)核苷酸是序列表中序列1的第67
‑
1266位的cDNA分子或DNA分子。
[0032]d3)与d1)或d2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
[0033]上文所述的E2蛋白也属于本专利技术的保护范围。
[0034]上文所述的生物材料也属于本专利技术的保护范围。
[0035]本专利技术首次使用原核表达的重组GETV E2蛋白建立了间接ELISA方法用于检测猪盖塔病毒抗体，结果表明该方法特异性较高，与CSFV、PRRSV等无交叉反应，重复性良好，批间和批内变异系数均小于10％。使用稀释倍数为1：640的阳性血清仍能准确检测出阳性，与金标准检测方法相比总符合率为96.7％。表明本专利技术建立的间接ELISA方法便于规模化应用，可作为目前GETV血清学检测及疫苗评价的可靠选择。
附图说明
[0036]图1为重组质粒pCOLD
‑
E2的PCR扩增及双酶切电泳结果。M：DL2000 DNAMarker；1：重组质粒的PCR产物；2：重组质粒双酶切产物。
[0037]图2为重组E2蛋白的表达及纯化SDS
‑
PAGE、Western blot鉴定结果。A和B为 SDS
‑
PAGE结果，M：蛋白分子质量标准，1：菌液，2：破碎后上清，3：破碎后沉淀， 4：纯化浓缩后的重组E2蛋白SDS
‑
PAGE结果；C为Western blot结果，5：重组E2 蛋白Western blot结果，6：阴性对照。
[0038]图3为鼠源多克隆抗体的Western
‑
blot和间接免疫荧光鉴定。A和B为Western
‑
blot 鉴定结果，M：蛋白质分子质量标准；1：重组E2蛋白；2：pCOLD阴性对照；C和 D为间接免疫荧光鉴定结果(
×
100)3：GETV病毒液；4：GETV感染BHK21细胞； 5：未感染GETV的BHK21阴性对照。C：GETV感染24h的BHK21间免结果；D： BHK21未感染对照。
[0039]图4为临界值的确定。横坐标为血清样品数目；纵坐标为S/P(样品OD
450nm
)值。
[0040]图5为间接ELISA特异性实验。横坐标为阳性血清病毒名称；纵坐标为S/P值。
[0041]图6为间接ELISA敏感性实验结果。横坐标为猪GETV阳性血清稀释倍数；纵坐标为S/P值。
具体实施方式
[0042]动物病毒：公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0043]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测猪盖塔病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被抗原，所述包被抗原为E2蛋白；所述E2蛋白为如下的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中序列4的第7
‑
406位；A2)氨基酸序列是序列表中序列4；A3)将A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)或A2)衍生的或与A1)或A2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A4)在A1)或A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标二抗抗体。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗抗体为HRP标记的山羊抗猪抗体。5.制备权利要求1
‑
4中任一权利要求所述的试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1中所述的E2蛋白包被于ELISA包被板的步骤；所述包被条件为37℃包被两小时。6.与权利要求1中所述的E2蛋白相关的生物材料的下述任一种应用：Q1、所述生物材料在制备检测检测猪盖塔病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，周远成，朱玲，王玉玲，黄瑶，谷思睿，
申请(专利权)人：畜科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：