一种猪丹毒rSpaA-Fc融合蛋白及其在疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种猪丹毒rSpaA

【技术实现步骤摘要】
一种猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白及其在疫苗中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白及其在疫苗制备中的应用。

技术介绍

[0002]猪源红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，俗称猪丹毒杆菌，是丹毒丝菌科丹毒丝菌属的一种兼性厌氧的革兰氏阳性的纤细小杆菌，可引起猪及其他动物的丹毒病。猪丹毒是一种急性、热性传染病，其临诊特征主要为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。猪丹毒杆菌有多种血清型，大多数由其中的血清1a型和2型引起。
[0003]目前，该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了很大的经济损失，也给人体健康带来威胁。猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病，造成严重的经济损失。预防猪丹毒最有效的方法是进行疫苗接种，目前市场上使用的疫苗主要是猪丹毒灭活菌苗和弱毒活菌苗，但在这两种疫苗中，弱毒菌株存在毒力返强的问题，而灭活疫苗存在灭活不彻底及免疫力低的问题。因此，研制新型亚单位疫苗是猪丹毒疫苗研究的主要方向，基因工程亚单位疫苗虽具有生物安全性高，操作简单，成本低等特点，但是其不能诱导细胞免疫是其制约因素，同时目前针对猪丹毒的新型亚单位疫苗设计主要是针对某一个基因型的SpaA蛋白(如申请号201910442887.2、申请号202011366261.7专利所示)，因此亟待对现有技术进行升级，提高抗体水平、免疫覆盖率和保护率。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白，同时制备含有该融合蛋白的亚单位疫苗产品，弥补现有技术的不足。
[0005]首先本专利技术公开了一种猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白，所述猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0006]所述猪丹毒rSpaA
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Fc蛋白氨基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的信号肽序列、如SEQ ID NO:4所示的T helper序列、如SEQ ID NO:5所示的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第一序列、如SEQ ID NO:7所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:8所述的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第二序列、如SEQ ID NO:9所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:10所示的猪丹毒血清1a SpaA保护性抗原第三序列、如SEQ ID NO:11所示的linker2序列、如SEQ ID NO:12所示的Fc序列以及如SEQ ID NO:13所示的6his标签序列首尾连接而成。
[0007]编码该猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；该基因按照大肠杆菌密码子偏好性进行了基因优化。
[0008]本专利技术的猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白用于制备猪丹毒亚单位疫苗和诊断试剂。
[0009]相比于现有技术，本专利技术设计的猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白制备的亚单位疫苗具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，抗体水平高，对猪丹毒基因1a和2型攻毒保护率高等特点，为生产上制备猪丹毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。
附图说明
[0010]图1实施例4采用ELISA测定猪血清中γ
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干扰素的检测结果。
具体实施方式
[0011]下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。
[0012]本专利技术实施列中所使用的试剂均为市售产品。
[0013]本专利技术试剂、菌株和质粒来源名单如下：
[0014]本专利技术所用感受态细胞BL21购自于北京擎科生物科技有限公司
[0015]培养基购自于上海源叶生物科技有限公司；
[0016]Gel02佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学品有限公司；
[0017]IFN
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γ细胞因子检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；
[0018]96孔酶标板购自康宁公司；
[0019]pET28a载体购自金斯瑞生物科技股份有限公司。
[0020]实施例1
[0021]rSpaA
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Fc序列合成及重组质粒构建
[0022]根据NCBI报道的猪丹毒血清2型菌株C43311(GenBank:EF635597.1)和猪丹毒血清1a型菌株LA150627(GenBank:KU214211.1)抗原猪丹毒SpaA序列，合成仅具有血清1a型抗原特征的SpaA
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DC1蛋白的序列、仅含有血清2型抗原特征的SpaA
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DC2蛋白的序列以及兼具猪丹毒血清1a型与血清2型抗原蛋白的rSpaA
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Fc融合蛋白的序列(SEQ ID NO:1)；SpaA
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DC1和SpaA
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DC2序列的大小为1239个碱基；rSpaA
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Fc序列含有2238个碱基；序列合成并连接至pET28a载体BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建原核表达载体pET28a
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SpaA
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DC1、pET28a
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SpaA
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DC2以及pET28a
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rSpaA
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Fc。
[0023]实施例2
[0024]表达菌株构建及蛋白诱导表达和纯化
[0025]SpaA
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DC1蛋白、SpaA
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DC2蛋白以及rSpaA
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Fc融合蛋白制备的方法包括以下步骤：1)BL21感受态细胞转化和阳性表达菌株鉴定；2)阳性菌株培养和蛋白诱导表达；3)包涵体纯化。
[0026]1)BL21感受态细胞转化和阳性表达菌株鉴定
[0027]将阳性质粒转化BL21感受态细胞，转化后挑取单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，8000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心3min离心取上清进行PCR鉴定,鉴定正确后扩大培养。
[0028]2)阳性菌株培养和蛋白诱导表达
[0029]将PCR检测阳性的菌株分别接种150mL TB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4h,培养物离心后用1/10体积的PBS重悬，进行超声破碎，
离心收获上清和沉淀进行蛋白鉴定。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白，其特征在于，所述的rSpaA
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Fc蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.根据权利要求1所述的猪丹毒rSpaA
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Fc融合蛋白，其特征在于，所述猪丹毒rSpaA
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Fc蛋白氨基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的信号肽序列、如SEQ ID NO:4所示的Thelper序列、如SEQ ID NO:5所示的猪丹毒血清1aSpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第一序列、如SEQ ID NO:7所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第一序列、如SEQ ID NO:8所述的猪丹毒血清1aSpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:6所示的linker1第二序列、如SEQ ID NO:9所示的猪丹毒血清2SpaA保护性抗原第二序列、如SEQ ID NO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜凤，周佳彬，张菁怡，仲鑫，黄金安，马宁宁，
申请(专利权)人：北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：