一种融合蛋白、生长激素及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种制备生长激素的方法。该方法包括：获取菌体的包涵体，包涵体包括融合蛋白，融合蛋白包括第一肽段和第二肽段，第一肽段为目标生长激素及其片段，第二肽段具有如式(I)所示的氨基酸序列，第一肽段的N端与第二肽段的C端相连；将融合蛋白通过切割酶进行酶切处理，形成游离的目标生长激素及其片段，游离的目标生长激素及其片段序列完整，未产生非特异性酶切，目标生长激素及其片段的N

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白、生长激素及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种融合蛋白、生长激素及其制备方法。

技术介绍

[0002]生长激素(human growth hormone，hGH)是由人脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸组成，分子量为22.1KDa，生长激素能够促进骨骼生长，促进机体蛋白质合成和脂肪分解，增加肌细胞的数量和增大肌细胞的体积，调节免疫系统增强免疫能力。生长激素可以用于儿童内源性生长激素缺乏引起的矮小症、特纳综合症、成人GHD、烧伤及创伤修复等症的治疗，还可以用于治疗慢性肾衰竭引起的身材矮小、短肠综合症及老年人延缓衰老等。但传统的制备方法存在表达量低、不易于实现大规模制备等缺点。
[0003]因此，亟需开发一种表达量高、易于大规模高效制备生长激素的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种生长激素的制备方法，该制备方法具有表达量高、易于大规模高效制备生长激素等优点。
[0005]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0006]国内外已上市的生长激素大多采用融合信号肽序列设计、周质腔可溶表达的形式进行制备。生长激素蛋白在信号肽的引导下，进入周质腔，信号肽序列在信号肽酶的作用下被切除，采取这种表达形式，可获得可溶性生长激素表达产物，但制备过程存在较多的问题需要解决。第一，关于信号肽序列的设计与选择，只有与生长激素蛋白相匹配的信号肽序列，才能将生长激素蛋白带入周质腔，否则会存在不能实现向周质腔的顺利转移，或者转移到周质腔内的生长激素蛋白仍然带有部分或完整的信号肽序列，从而影响生长激素蛋白的N端序列和结构。第二，关于表达量低，因为信号肽生长激素融合蛋白(简称信号肽融合蛋白)的表达，必须经过胞内表达、跨膜转运、信号肽切割、加工等一系列过程，决定了生长激素蛋白的表达量相对较低，若实现较高的表达量，上述任意一个步骤或过程出现问题，都会导致融合蛋白质不能顺利进入周质腔空间内，达不到靠信号肽实现分泌表达的目的，或产生不溶性的信号肽融合蛋白包涵体。第三，关于表达产物的纯化，依托信号肽分泌制备可溶生长激素蛋白时，在提取过程中，首先要经过破菌过程来实现，而这部分生长激素蛋白(可溶目标蛋白)同其他宿主细胞蛋白一样，会存在于破菌液的上清之中，除此之外，破菌上清中还含有大量的宿主DNA、宿主RNA等核酸杂质；多组分蛋白或核酸杂质的存在，给后续纯化造成巨大的压力，经过多步骤纯化至最后，导致生长激素蛋白要么纯度低、要么收率低。第四，关于大规模高效制备，因为靠信号肽分泌表达量低，为实现大规模制备必须有更大规模的发酵及纯化体系做支撑，更重要的是，过分大的发酵及纯化体系，给工艺放大带来巨大的工艺不确定性，甚者还会影响到产品的质量。生物制品一般都有严格的质量要求，纯度既是
其要求的重要质量标准内容之一，为获得符合质量标准要求的生长激素蛋白制品或高纯度的生长激素蛋白制品，会导致当前制备方法下，生长激素蛋白的收率极大降低，显著提高制备成本，非大规模制备的优选方法。
[0007]然而，专利技术人通过对生长激素蛋白的结构、特性、表达生长激素蛋白的基因工程菌的生长特性及纯化方法的充分研究，意外地发现生长激素蛋白采取包涵体表达形式，能完全克服上述信号肽分泌表达的缺陷和不足。
[0008]基于此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种融合蛋白。根据本专利技术的实施例，所述融合蛋白包括第一肽段和第二肽段，所述第一肽段为目标生长激素及其片段，所述第二肽段具有如式(I)所示的氨基酸序列，所述第一肽段的N端与所述第二肽段的C端相连；MXB(I)；其中，M为甲硫氨酸，X为保护序列，B为酶切位点；所述融合蛋白适于通过切割酶切割形成游离的所述目标生长激素及其片段，所述目标生长激素及其片段不被所述切割酶切割，游离的所述目标生长激素及其片段的N
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末端不含有额外的氨基酸残基。根据本专利技术实施例的融合蛋白在菌体中以包涵体的形式表达，无需跨膜分泌，在宿主菌体中具有高表达等优点。
[0009]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种制备生长激素的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：获取菌体的包涵体，所述包涵体包括融合蛋白，所述融合蛋白包括第一肽段和第二肽段，所述第一肽段为目标生长激素及其片段，所述第二肽段具有如式(I)所示的氨基酸序列，所述第一肽段的N端与所述第二肽段的C端相连；将所述融合蛋白通过切割酶进行酶切处理，形成游离的所述目标生长激素及其片段，所述目标生长激素及其片段不被所述切割酶切割，游离的所述目标生长激素及其片段的N
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末端不含有额外氨基酸残基；MXB(I)；其中，M为甲硫氨酸，X为保护序列，B为酶切位点。专利技术人经过大量试验得到上述融合蛋白，其在菌体中无需跨膜分泌，可以包涵体的形式表达，具有高表达等优点；然后采用切割酶对融合蛋白进行酶切，可将第二肽段完全移除，从而获得与天然人生长激素序列完全一致的第一肽段(即为目标生长激素及其片段)。因此，本专利技术的方法具有产量高等优点，适用于大规模的商业化生产。
[0010]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种生长激素。根据本专利技术的实施例，所述生长激素的纯度不低于99.5％。根据本专利技术实施例的生长激素具有纯度高等优点。
[0011]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0012]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0013]图1为本专利技术实施例1中编码融合蛋白的核苷酸序列及其Xba I酶切位点和BamH I酶切位点的位置；
[0014]图2为本专利技术实施例2中二级发酵后人生长激素融合蛋白表达SDS
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PAGE电泳；
[0015]图3为本专利技术实施例2中离心回收后人生长激素融合蛋白表达SDS
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PAGE电泳；
[0016]图4为本专利技术实施例5中人生长激素原液的SEC
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HPLC液相纯度分析图；
[0017]图5为本专利技术实施例7中人生长激素注射液完整分子量测定质谱图；
[0018]图6为本专利技术实施例7中人生长激素蛋白二硫键定位(LC/MS)图；
[0019]图7为本专利技术实施例9中TB03注射液大鼠体内药效试验各试验组AUC(
体重增长克数)
的组间比较柱状图；
[0020]图8为本专利技术实施例9中TB03注射液大鼠体内药效试验各试验组骨骺板厚度的比较柱状图。
具体实施方式
[0021]下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0022]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，包括第一肽段和第二肽段，所述第一肽段为目标生长激素及其片段，所述第二肽段具有如式(I)所示的氨基酸序列，所述第一肽段的N端与所述第二肽段的C端相连；MXB(I)；其中，M为甲硫氨酸，X为保护序列，B为酶切位点；所述融合蛋白适于通过切割酶切割形成游离的所述目标生长激素及其片段，所述目标生长激素及其片段不被所述切割酶切割，游离的所述目标生长激素及其片段的N
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末端不含有额外的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述酶切位点的序列为DDDDK。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述保护序列包含1～25个氨基酸；优选地，所述保护序列包含1～15个氨基酸，优选为1～10个；更优选地，所述保护序列包含3个氨基酸；优选地，所述保护序列中氨基酸各自独立地为空、F、T和P；优选地，所述保护序列的氨基酸序列为FTP；任选地，所述第二肽段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述目标生长激素及其片段具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％和95％同一性的氨基酸序列。5.一种制备生长激素的方法，其特征在于，包括：获取菌体的包涵体，所述包涵体包括融合蛋白，所述融合蛋白包括第一肽段和第二肽段，所述第一肽段为目标生长激素及其片段，所述第二肽段具有如式(I)所示的氨基酸序列，所述第一肽段的N端与所述第二肽段的C端相连；将所述融合蛋白通过切割酶进行酶切处理，形成游离的所述目标生长激素及其片段，所述目标生长激素及其片段不被所述切割酶切割，游离的所述目标生长激素及其片段的N
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末端不含有额外的氨基酸残基；MXB(I)；其中，M为甲硫氨酸，X为保护序列，B为酶切位点。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切位点的序列为DDDDK；优选地，采用重组牛肠激酶对所述融合蛋白进行酶切处理；优选地，所述酶切处理是在1～10℃、pH值为8.0～8.2条件下进行11～19h；任选地，所述重组牛肠激酶和所述融合蛋白的质量比为1：(2000～6000)，优选为1：(3000～5000)。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述保护序列包含1～25个氨基酸；优选地，所述保护序列包含1～15个氨基酸，优选为1～10个；优选地，所述保护序列中氨基酸各自独立地为空、F、T和P；优选地，所述保护序列的氨基酸序列为FTP；任选地，所述第二肽段具有如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菲，沈玉保，包国庆，郭力鸣，
申请(专利权)人：君合盟生物制药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：