重组A型肉毒素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组A型肉毒素的制备方法。所述方法包括：采用基因重组的方法进行制备，构建分别表达轻链蛋白、重链蛋白的基因工程菌；将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物按比例混合，进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。本发明专利技术的方法工艺简单、制备流程短，制备得到的A型肉毒素的纯度高、毒性高。毒性高。

【技术实现步骤摘要】
重组A型肉毒素的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种重组A型肉毒素的制备方法，更具体地，本专利技术涉及一种基因重组制备A型肉毒素的方法和A型肉毒素。

技术介绍

[0002]肉毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌(简称“肉毒梭菌”)产生的神经毒素，是世界上已知毒性最强的物质之一，肉毒素分为7种类型的血清型(A型
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G型)，其中最常见的为A型，称为A型肉毒素(Botulinum neurotoxin of type A，BoNT/A)。多项研究表明，BoNT/A具有广泛的应用前景，不仅在医学美容方面，随着在各种肌张力障碍、手足多汗症、疼痛以及其他疑难杂症等领域的临床应用，其治疗范围在不断扩大。
[0003]BoNT/A的结构分为两部分：轻链(LC，50kD)和重链(HC，100kD)，轻链和重链间靠一对二硫键链接(C430
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C454)，非酰胺键链接。轻链为活性结构域，具有锌依赖性金属内肽酶活性，是毒素的毒性部分；重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因重组制备A型肉毒素的方法，其特征在于，包括：将轻链蛋白进行第一变性处理，得到第一变性产物；将重链蛋白进行第二变性处理，得到第二变性产物；将所述第一变性产物和第二变性产物进行复性及组装处理，获得所述A型肉毒素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；任选地，所述重链蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述轻链蛋白或重链蛋白是通过如下方式获得的：将质粒导入大肠杆菌中，所述质粒携带编码所述轻链蛋白或重链蛋白的基因；将导入有所述质粒的大肠杆菌在适于蛋白表达的条件下进行培养、诱导，离心收获菌体、菌体破碎、离心破碎产物，获得所述轻链蛋白或重链蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一变性处理和所述第二变性处理在变性缓冲液中进行，所述变性缓冲液包括：5～10M尿素、5～15mM二硫苏糖醇和10～30mM Tris或Tris
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HCl；任选地，所述变性缓冲液的pH值为9.5～10.5。5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，进行所述复性及组装处理之前，预先将所述第一变性产物和所述第二变性产物进行混合处理，得到变性混合液；任选地，所述混合处理中所述第一变性产物和所述第二变性产物的体积比为1:(1～10)；任选地，所述复性及组装处理在复性及组装缓冲液中进行，所述复性及组装缓冲液包括：50～150mM NaCl、0.1～1.0mM ZnCl2、0.1～1.0mM CaCl2、1.0～10.0mM还原性谷胱甘肽、1.0～10.0mM氧化性谷胱甘肽、40～50mM Tris
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HCl和0.4～0.6％吐温20；任选地，所述复性及组装缓冲液的pH值为9.5～10.5；任选地，所述变性混合液与复性及组装缓冲液的体积比例为1:(1～10)。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述复性及组装处理的处理时间为12～16h；任选地，所述复性及组装处理的搅拌转速为50～200rpm。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将所述复性及组装处理得到的组装液依次经过疏水层析、硫酸铵盐析、透析、阴离子层析和分子筛层析处理，获得所述A型肉毒素。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述疏水层析处理的流动相A1包括10～30mmol/L Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭力鸣，包国庆，沈玉保，李佳男，吴琪，孙宝财，蔡元宁，王超，高欣，马庆男，
申请(专利权)人：君合盟生物制药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：