生长激素融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，其中，根据本发明专利技术的实施例，生长激素融合蛋白包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。根据本发明专利技术的实施例，通过采用生长激素与双链结构体的融合，能够延长生长激素在体内的半衰期，并且由于每个双链结构体仅携带一个生长激素，因此生长激素的活性位点并不受到空间位阻的影响，因此其活性更强，另外由于生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，因此安全性更高。因此安全性更高。因此安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
生长激素融合蛋白及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，更具体地，本专利技术涉及一种生长激素融合蛋白、一种核酸分子、一种表达载体、一种重组细胞、一种制备生长激素融合蛋白的方法、一种药物组合物以及生长激素融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞或者药物组合物在制备药物中的用途。

技术介绍

[0002]生长激素(human growth hormone，hGH)是由人脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸组成，分子量为22.1KDa，生长激素能够促进骨骼生长，促进机体蛋白质合成和脂肪分解，增加肌细胞的数量和增大肌细胞的体积，调节免疫系统增强免疫能力。生长激素可以用于儿童内源性生长激素缺乏引起的矮小症、特纳综合症、成人GHD、烧伤及创伤的修复等症的治疗，还可以用于治疗慢性肾衰竭引起的身材矮小、短肠综合症及老年人延缓衰老等。
[0003]国内已上市的长效生长激素主要是通过PEG化来延长其半衰期，达到长效的目的。但是，有报道称将PEG化的重组人生长激素用于患有生长激素缺乏症的儿童时，患儿体内的胰岛素样生长因子
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1(IGF
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1)水平没有能够恢复至正常水平。在临床前动物试验过程中发现反复给予试验动物注射PEG化的蛋白药物会引起空泡病变。另外，常规的生长激素表达产物，特别是以大肠杆菌表达的生长激素，由于目的蛋白基因起始必须碱基ATG的存在，使表达蛋白N末端必然含有甲硫氨酸，要想获得N末端不含甲硫氨酸的生长激素，需借助蛋白N端融合信号肽的作用来实现。N末端甲硫氨酸的存在，特别是生长激素的N末端甲硫氨酸的存在，会给治疗带来副作用。
[0004]因此，现有的长效生长激素技术仍有待改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术充分考虑了生长激素现有技术中存在的上述问题，并在进一步对重组生长激素进行研究过程中，意外发现部分表达体系，例如大肠杆菌能够直接表达在N末端不携带甲硫氨酸的生长激素，而不需要借助信号肽的作用来实现。
[0006]因此，本专利技术提出了一种能够有效制备N末端不携带甲硫氨酸的重组生长激素的方法。
[0007]第一方面，本专利技术提出一种生长激素融合蛋白，根据本专利技术的实施例，其包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。根据本专利技术的实施例，通过采用生长激素与双链结构体的融合，能够延长生长激素在体内的半衰期，并且由于每个双链结构体仅携带一个生长激素，因此生长激素的活性位点并不受到空间位阻的影响，因此其活性更强，另外由于生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，因此安全性更高。
[0008]第二方面，本专利技术提出了一种核酸分子，根据本专利技术的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的生长激素融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。
[0009]第三方面，本专利技术还提出了一种表达载体，根据本专利技术的实施例，所述表达载体携带第二方面所述的核酸分子。利用该表达载体能够在细胞内有效地表达上述融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述生长激素的单体，并进一步通过体外组装形成最终的生长激素融合蛋白。
[0010]第四方面，本专利技术还提出了一种重组细胞，根据本专利技术的实施例，该重组细胞含有：前面所述的核酸分子；或者前面所述的表达载体。
[0011]第五方面，本专利技术还提出了一种制备第一方面所述的生长激素融合蛋白的方法，其包括：获取双链结构体的第一单体和第二单体，其中，所述第一单体具有第一恒定区Fc段，所述第二单体具有第二恒定区Fc段，所述第一恒定区Fc段连接有生长激素；和使所述第一单体和所述第二单体形成异二聚体，以便获得所述生长激素融合蛋白。
[0012]由此，能够有效地制备前面所述的生长激素融合蛋白。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述异二聚体是在体外形成的。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述第一单体和所述第二单体是在非哺乳细胞表达体系中表达的。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述第一单体和所述第二单体是相同的所述非哺乳细胞表达体系中表达的。
[0016]第六方面，本专利技术提出了一种药物组合物，其包括：
[0017]第一方面所述的生长激素融合蛋白。
[0018]第七方面，本专利技术还提出了前面所述的生长激素融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、前面所述的制备融合蛋白的方法制备获得的生长激素融合蛋白、药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特纳综合征、慢性肾功能衰竭引起的身材矮小、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、短肠综合症、FGFR3突变的软骨发育不全。
附图说明
[0020]图1显示了根据本专利技术实施例的融合蛋白结构示意图；
[0021]图2显示了本专利技术生长激素融合蛋白在体内促进动物生长中的作用。
具体实施方式
[0022]下面详细描述本专利技术的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0023]在对本专利技术描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本专利技术保护方案的限制。
[0024]如无特别说明，在本文中所使用的术语“生长激素”是指人生长激素或者与人生长
激素具有相同或者一定同源性但生物学功能不受负面影响的蛋白(或者称为“变体”)，本领域技术人员能够容易通过已知的天然人生长激素的氨基酸序列结合常规的基因编辑手段获得期望的定点突变。
[0025]如无特别说明，在本文中所使用的术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白质或者多肽融合而成的新型蛋白，通常可以通过基因工程等技术实现上述融合操作，例如通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。在本文中是指，生长激素与双链结构体的Fc段呈融合状态，需要说明的是，生长激素融合蛋白并不意味着蛋白质的所有部分都是通过融合的方式形成的，例如，双链结构体中的两个Fc段部分是可以通过二硫键等化学键连接在一起的。
[0026]如无特别说明，在本文中所使用的术语“同一性”可以通过常规的方法进行确定两个蛋白质序列之间的同一性，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley
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Interscience，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生长激素融合蛋白，其特征在于，包括：双链结构体，所述双链结构体具有第一恒定区Fc段和第二恒定区Fc段；和生长激素，所述生长激素与所述双链结构体的所述第一恒定区Fc段相连，其中，所述生长激素的N末端不具有甲硫氨酸，所述生长激素融合蛋白是由非哺乳细胞表达体系表达的。2.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素融合蛋白无糖基化修饰。3.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述非哺乳细胞表达体系至少包括原核表达体系和低等真核表达体系二者之一，优选所述非哺乳细胞表达体系至少包括大肠杆菌表达体系和酵母表达体系的二者之一。4.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素具有下列氨基酸序列之一：(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，X1FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQX2RSVEGSX3GF，X1表示G、A或S，X2表示G、A、S、C或缺失，X3表示G、A、S、C或缺失；或(b)与(a)具有至少90％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，进一步包括：连接肽，所述连接肽的一端与所述生长激素相连，另一端与所述双链结构体相连，所述连接肽含有至少一个序列单元GXaa1PXaa2，其中，在每个所述序列单元中，每个Xaa1分别独立地表示A、E和K之一，每个Xaa2分别独立地表示Q和N之一。6.根据权利要求5所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述连接肽含有1～20个所述序列单元，优选1～5个，更优选3个。7.根据权利要求5所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述生长激素的C末端与所述连接肽相连。8.根据权利要求1所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段具有不同的氨基酸序列。9.根据权利要求8所述的生长激素激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段适于在体外形成异二聚体。10.根据权利要求8或9所述的生长激素融合蛋白，其特征在于，所述第一恒定区Fc段和所述第二恒定区Fc段分别独立地具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：SKYGPPX4PPX5PAPX6AX7GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFX8STYRVVSVLTVLHQDWLX9GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS
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【专利技术属性】
技术研发人员：包国庆，郭力鸣，沈玉保，高欣，李佳男，王超，吴琪，孙宝财，
申请(专利权)人：君合盟生物制药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：