一种高效杂交瘤融合方法技术

本发明专利技术公开了一种高效杂交瘤融合方法，具体方法为构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合表达质粒载体；上述载体在骨髓瘤细胞SP2/0中转录翻译形成融合蛋白（命名为MGCP）并被转运至细胞表面；骨髓瘤细胞表面的MGCP蛋白可识别结合小鼠脾细胞表面的CD19蛋白，通过上述两种蛋白的结合可实现骨髓瘤细胞和脾细胞在物理空间上的定向紧密贴合；在PEG和电击诱导融合时，两种细胞的融合效率可提升10

【技术实现步骤摘要】
一种高效杂交瘤融合方法


[0001]本专利技术属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及一种高效杂交瘤融合方法。

技术介绍

[0002]杂交瘤技术是在正常体细胞融合的基础上发展而来的，Kohler和Milstein在1975年首次实现免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成了B淋巴细胞
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骨髓瘤细胞杂合体，此杂合体既具有骨髓瘤细胞能在体外培养中快速无限增殖的特点，又具有B淋巴细胞可分泌单克隆抗体的优点。传统经典的杂交瘤技术是利用PEG将HGPRT基因缺陷型骨髓瘤细胞SP2/0与免疫动物的脾细胞进行融合，利用HAT选择性培养基可将正确融合的杂交瘤细胞筛选和培养出来。再通过常规的检测技术如ELISA、FACS等，将能分泌针对特定蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤克隆筛选出来，利用有限稀释的方法对阳性克隆进行亚克隆，亚克隆后得到的细胞即是能分泌均一性单克隆抗体的细胞。
[0003]传统的杂交瘤技术虽然实现了单克隆抗体分泌细胞的永生化，但存在着细胞融合效率较低的问题，在融合体系中可能存在大量未融合的骨髓瘤细胞、脾细胞以及错误融合的骨髓瘤细胞
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骨髓瘤细胞、脾细胞
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脾细胞等，骨髓瘤细胞和脾细胞融合率约为几万分之一；同时使用高浓度的PEG对细胞具有毒害作用，不利于后续融合细胞的培养和筛选。

技术实现思路

[0004]传统的杂交瘤融合技术的融合效率较低，不能有效提供庞大的抗体库进行筛选高质量抗体，为解决融合效率低的问题，本专利技术提供一种高效杂交瘤融合方法。
[0005]在融合反应发生前脾细胞和骨髓瘤细胞通过细胞表面的配体
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受体蛋白特异性性识别结合，上述两种细胞的紧密结合提高融合时脾细胞和骨髓瘤细胞发生细胞膜融合的概率，具体方法为：S1、构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合序列，融合蛋白命名为MGCP，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；S2、对上述融合蛋白MGCP氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，得到优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；S3、将上述核苷酸序列委托合成后构建至PLVX
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puro慢病毒表达载体，上述载体转染骨髓瘤细胞SP2/0后转录翻译形成融合蛋白MGCP并被转运至细胞表面，MGCP识别结合小鼠脾细胞表面的CD19蛋白，通过上述两种蛋白的结合可实现骨髓瘤细胞和脾细胞在物理空间上的定向紧密贴合。在PEG和电击诱导融合时，两种细胞的融合效率可提升10
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20倍。
[0006]融合蛋白MGCP经优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]atgtaccggatgcagctgctgagctgtatcgccctgtctctggccctggtcaccaacagcgaagtgaaagtgatcgagagcggcggaggactggttcagcctggcggatctctgaagctgtcttgtgccgccagcggcttcgacttcaacagatactggatgacctgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcgagatcaaccccgacagcagcagcatcaactacagccctagcctgaaggccaagttcatcatcagcagagacaacgccaagaacaccct
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[0008]MYRMQLLSCIALSLALVTNSEVKVIESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFNRYWMTWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSSINYSPSLKAKFIISRDNAKNTLYLQMSQVRSEDTALYYCARRGYGFDWLVYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDILMIQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术将CD19scfv与IL2信号肽和CD28跨膜结构域融合串联表达成一个新的蛋白，对其相应的核苷酸序列进行密码子优化，最终得到对应的核苷酸序列，将核苷酸序列委托合成后构建至PLVX
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puro慢病毒表达载体。
[0009]本专利技术在融合反应发生前脾细胞和骨髓瘤细胞通过细胞表面的配体
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受体蛋白特异性性识别结合，两种细胞的紧密结合提高融合时脾细胞和骨髓瘤细胞发生细胞膜融合的概率。和传统杂交瘤细胞融合方法相比，本专利技术可提高杂交瘤融合效率10倍以上，为后续单克隆抗体筛选构建了相对比较庞大的群落，避免了传统方法需要多批次平行融合的问题。
附图说明
[0010]图1本专利技术单克隆抗体可用性评估中对照组和试验组试剂与国外知名品牌产品相关性分析图。
具体实施方式
[0011]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0012]实施例1融合蛋白MGCP表达载体构建在以往研究中，本公司发现了一个CD19scfv蛋白对CD19蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效杂交瘤融合方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建IL2信号肽、特定的CD19scfv蛋白和CD28跨膜结构域融合序列，融合蛋白命名为MGCP，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；S2、对上述融合蛋白MGCP氨基酸序列对应的核苷酸序列进行密码子优化，得到优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；S3、将上述核苷酸序列委托合成后构建至PLVX
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puro慢病毒表达载体，上述载体转染骨髓瘤细胞SP2/0后转录翻译形成融合蛋白MGCP并被转...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓加武，王明强，吕奕，芮兵，
申请(专利权)人：南京佰抗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：