一种软组织细胞外基质提取方法技术

本发明专利技术公开了一种软组织细胞外基质提取方法，包括将动物软组织浸入处理液中溶胀、超声处理；将材料转移至水或缓冲液中，冷却，超声处理；将处理完成的材料用水或缓冲液振荡清洗，得细胞外基质材料。本发明专利技术方法能将细胞外基质提取工艺中时间减短至3‑4h，脱细胞工艺时间能缩短至30min，同时能保证免疫物质能够充分脱除效果，不仅提高工艺效率，也不影响免疫脱除质量，更是降低了长时间的表面活性剂对胶原网络的毒化作用，相对保留了外基质更多的生物活性。

A method of extracting extracellular matrix from soft tissue

【技术实现步骤摘要】
一种软组织细胞外基质提取方法
本专利技术涉及生物材料领域，具体涉及一种软组织细胞外基质提取方法，可用于生物材料生产制备及医疗器械加工制造。
技术介绍
细胞外基质是一种结构蛋白和功能蛋白组成的复杂混合物，主要由胶原、糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖以及弹性蛋白等组成，构成了细胞生命活动的微环境，维持细胞自身的功能及细胞间的交流，由于其中不含有诱发免疫识别的物质，在移植至异体受体时，不会被免疫识别为异物，而且可以支持宿主细胞的生长，甚至能诱导细胞的定向分化。细胞外基质来源于动物组织，其中免疫物质主要集中在组织中的细胞核内，提取细胞外基质的原理也就是将细胞免疫核物质脱除。目前最广泛使用的方法是化学与物理法相结合，物理法破坏细胞结构，化学法漂洗出细胞碎片，但是即使在对工艺优化后，免疫脱除工艺周期仍然可能长达24h，对细胞结构的破坏仍旧难以降低。在生物学中，常利用超声的空泡效应、热效应及机械效应来作进行细胞破碎。在超声的声压震荡作用下，会在透过的液体介质中形成空泡，在超声波纵横波交替正负压强下受到压缩和拉伸，出现猛烈聚爆，产生几十兆帕至上百兆帕巨大的瞬时压力，同时会出现上千度的瞬时高温，从而能快速使细胞结构破裂。在外基质提取中，细胞结构破碎后，大量的非水溶性的免疫碎片还是可能残留于外基质骨架内，因此还需要结合一定的化学方法，如表面活性剂处理，将其中的细胞碎片增溶去除。但是，高能量密度超声的空泡效应、热效应及机械效应可能对外基质骨架造成不可逆的损伤。胶原在42℃左右就会发生热收缩，导致外基质胶原纤维网变形，蛋白质空间结构也发生改变，严重降低活性，不再适合细胞的爬行生长。因此，最初仅使用超声破碎组织和细胞结构以提取其中的核物质或蛋白，外基质网会在提取中几乎被完全破坏。后期经过研究和改进，对超声频率和功率进行细化调整后，已经能在骨、血管、真皮、筋膜等较硬组织的脱细胞处理中使用，其胶原网空间结构较难被破坏，而且后续应用部位对其空间结构要求并不是非常高，只要能保证基本的骨架和取向即可，已能缩短处理时间，提高处理效率。但是，在超声应用于角膜、羊膜、脊髓等软组织的脱细胞处理时，由于其纤维网力学强度非常低，超声可能会对其造成较严重的影响。尤其是角膜，由于其纤维束层层相叠组成的结构非常精密，轻微的结构破坏就会导致整体性能的缺陷，降低光学透过性，以至于材料根本无法进行后续使用。已有脱细胞工艺如CN201811591406将羊膜超声处理，然后物理刮除所述羊膜上的细胞；CN201810862285用了碱法与超声辅助破碎鱼皮细胞及辅助交联，用于口腔修复，而CN201810429745用超声和酶法结合处理小肠粘膜下层作为硬膜补片，此两种工艺材料都是选择的力学强度较高的硬质膜，因此超声对材料破坏小，也不要求光学性能。这些处理工艺时间用于角膜的脱细胞处理时，由于时间仍然较长、试剂性破坏性大等原因，工艺并不适用。通过设计适当的工艺更大幅度缩短脱细胞时间并减小结构破坏，才能保证利用超声对角膜等软组织细胞外基质进行快速提取而不造成结构损伤。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种软组织细胞外基质提取方法。能大幅度缩短脱细胞时间并减小结构破坏，保证利用超声对角膜等软组织细胞外基质进行快速提取而不造成结构损伤。本专利技术所采取的技术方案是：一种软组织细胞外基质提取方法，包括以下步骤：1）将经过前处理后的动物软组织浸入处理液中溶胀1-60min，用频率为15-40kHz，功率为30-300W的超声处理0.5-30min；2）将材料转移至水或缓冲液中，冷却至-18-4℃，用频率为15-40kHz，功率为3-50W的超声处理0.5-1min；3）将处理完成的材料用水或缓冲液洗净，得细胞外基质材料。优选的，所述步骤3）水为纯化水，所述缓冲液为PBS溶液。优选的，所述动物软组织为缝合力≤10N的动物组织。优选的，所述动物软组织为角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经中的至少一种。优选的，所述处理液为含0.05-2%wt表面活性剂的水溶液。优选的，所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、硫代甜菜碱10、曲拉通X-100、脱氧胆酸钠中的至少一种。优选的，所述处理液还含有0.01%-50%wt助剂。优选的，所述助剂为丙三醇、丙二醇、山梨醇、丁二醇、氯化镁、氯化钙中的至少一种。优选的，所述动物软组织在浸入处理液前是经除去多余组织、洗净、消毒处理的动物软组织。优选的，所述步骤1）和2）中的超声处理独立选自连续或脉冲超声。优选的，所述脉冲处理工艺为1-5s开，关时长每次比开时长多1s。优选的，所述步骤3）洗净为振荡清洗。优选的，振荡清洗次数1-3次，每次10min。上述软组织细胞外基质提取方法应用于生物材料及医疗器械加工制造中，主要能用于快速提取角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经等细胞外基质，可在后续作为生物材料或用作再生型医疗器械。本专利技术中，缝合力测量时，是利用万用拉力机将单股穿透组织较薄侧的5-0缝线两侧同时向材料反方向拉伸，在线对材料剪切拉出过程中的最大力，能模拟真实材料缝合后材料受力情况。一般来说，角膜缝合力约为2N、结膜缝合力约为1N、羊膜约为0.1N、脊髓约为0.05N、神经为4-10N；细胞外基质骨、肌肉等较硬、厚的组织等缝合力都在10N以上。本专利技术中，将动物软组织浸入处理液中溶胀，是为了使处理液中成分在原材料中分散，材料与处理液中能达到一定的溶胀平衡。本专利技术中，将温度降低至-18-4℃下进行超声处理，目的是通过降低温度，以减轻后续超声处理中的热效应，减少局部过热引起的变形及活性降低。本专利技术中，步骤1）超声频率选择15-40kHz范围，功率为30-300W时处理能保证各样品在处理液中的处理效果，使得细胞成分在协同作用下能够被破碎和洗出，在连续或脉冲超声处理下，仅需处理0.5min-30min就可保证处理完全。本专利技术中，振荡清洗优选振荡清洗1-3次，每次10min，即可基本洗出其中的细胞物质及残余处理液，提取出较纯净的细胞外基质材料。本专利技术中，处理液中添加的表面活性剂主要用途为将材料内细胞物质洗脱及洗出。十二烷基硫酸钠（SDS）、硫代甜菜碱10、曲拉通X-100、脱氧胆酸钠为化学脱细胞工艺常用表面活性剂，但由于其同时对外基质生物活性具有毒化作用，因此选用浓度为0.05%-2%wt等较低浓度以降低变性破坏作用，增强洗脱效果。本专利技术中，处理液中添加助剂，主要也是利于降低超声带来的空泡效应、热效应及机械效应。降低温度能够降低热效应，但是在稀溶液降低到0℃以下时，即使整体不凝固，材料局部也会发生冰晶化反应出现微相分离，而在超声作用下能量主要集中在此类相界面上，反而增加了机械效应和热效应，严重损伤胶原网格结构。因此，在加入本专利技术优选浓度的丙三醇、丙二醇、山梨醇、丁二醇、氯化镁、氯化钙等后，能够降低整体的凝固点，防止出现因为结晶出现导致的局部相分离，或能够被外基质吸附起到增韧作用，也相当于增加了各相间的相容性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软组织细胞外基质提取方法，包括以下步骤：/n1）将经过前处理后的动物软组织浸入处理液中溶胀1-60min，用频率为15-40kHz，功率为30-300W的超声处理0.5-30min；/n2）将材料转移至水或缓冲液中，冷却至-18 - 4℃，用频率为15-40kHz，功率为3-50W的超声处理0.5-1min；/n3）将处理完成的材料用水或缓冲液洗净，得细胞外基质材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种软组织细胞外基质提取方法，包括以下步骤：
1）将经过前处理后的动物软组织浸入处理液中溶胀1-60min，用频率为15-40kHz，功率为30-300W的超声处理0.5-30min；
2）将材料转移至水或缓冲液中，冷却至-18-4℃，用频率为15-40kHz，功率为3-50W的超声处理0.5-1min；
3）将处理完成的材料用水或缓冲液洗净，得细胞外基质材料。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述动物软组织为缝合力≤10N的动物组织。


3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述动物软组织为角膜、结膜、羊膜、脊髓、神经。


4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述处理液为含0.05-2%wt表面活性剂的水溶液。


5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：别拓铭，杜霖，易静楠，官习鹏，
申请(专利权)人：广州悦清再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44