一种成熟肝细胞的长期体外培养方法技术

本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，提供了一种采用微阵列玻片作为培养支持物进行成熟肝细胞的长期体外培养方法，包括如下步骤：A、采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被微阵列玻片，于4℃保存过夜；B、采用不含有基质胶的BM培养体系将原代肝细胞种植于预先包被的微阵列玻片上，2小时后换液去除未贴壁细胞，之后每天换液，直至3周。其中，BM培养体系包括液体基础培养基、0～5×B27添加剂、0～5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0‑100mM尼克酰胺、0‑1mM地塞米松、0‑500μg/mL维生素C。经检测，微阵列玻片上培养的肝细胞几乎无应力纤维产生，Alb和Hnf4α等成熟肝细胞的标志物的表达可以得到长期维持，从而实现长期维持肝细胞的功能和表型。

A long-term culture method of mature hepatocytes in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种成熟肝细胞的长期体外培养方法
本专利技术涉及生物医药工程
，涉及一种能够在体外长期维持肝细胞功能的培养方法。
技术介绍
肝脏是维持体内稳态的核心器官，发挥着诸如代谢、糖原贮存、药物解毒、多种血清蛋白合成以及胆汁分泌等广泛的作用。目前全世界有超过3亿人受到肝脏疾病的困扰，仅在我国每年因肝病死亡的患者超过30万。对于终末阶段肝病，唯一可能的治疗手段便是肝移植，但是每年可供移植肝脏仅能满足5％肝病患者的需求，可供移植肝脏的匮乏严重限制了该治疗手段的临床应用。虽然近期由多能干细胞分化或者通过谱系重编程来得到的肝细胞或肝祖细胞的研究取得了显著的进步，但在体外得到与体内肝细胞功能相近的肝细胞依旧十分困难。即便是刚分离得到的原代肝细胞在体外培养中短时间内就会丧失肝细胞的关键功能。因此，无法于体外维持成熟肝细胞的功能一直是阻碍细胞移植治疗应用以及得到有效的药物筛选平台的瓶颈。导致体外培养的肝细胞去分化的驱动因素仍未被发现，而明确肝细胞去分化的机制对于设计出在体外有效维持肝细胞表型和功能的方法有非常重要的意义。目前，诸多研究将着眼点集中于肝细胞培养中的培养条件配置以及培养基优化上，体外培养的肝细胞所处的微环境与体内环境有巨大的差异；在体内，肝细胞处于一种三维的柔软而弹性的环境中，肝细胞大体呈立方体结构；而在体外，肝细胞通常培养于坚硬的二维培养支持物上，细胞铺展，细胞呈高张力状态，形态高度扁平化。因此我们设想能否通过模拟肝细胞的体内环境，抑制肝细胞的铺展，降低肝细胞的细胞张力实现成熟肝细胞的长期体外培养。>
技术实现思路
本专利技术是为解决上述问题而进行的，针对现有技术中成熟肝细胞体外培养过程中难以维持肝细胞的分子表型和各项功能的缺陷，建立基于模拟体内环境、抑制细胞张力的原理，提供了一种全新地成熟肝细胞的长期体外培养方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法，采用微阵列玻片作为培养支持物，具有这样的技术特征，包括如下步骤：A、采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被微阵列玻片，于4℃保存过夜；B、采用不含有基质胶的BM培养体系将原代肝细胞种植于预先包被的所述微阵列玻片上，2小时后换液去除未贴壁细胞，之后每天采用该不含有基质胶的BM培养体系换液，直至3周。其中，BM培养体系包括液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0-100mM尼克酰胺、0-1mM地塞米松、0-500μg/mL维生素C。本专利技术中的微阵列玻片购买自CytooSA公司的10-001-00-18型号，或者通过光蚀刻技术、聚丙烯酰胺水凝胶等制备微阵列玻片。优选的，在本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法中，微阵列玻片上设置有300-1600μm2的细胞可贴附点阵，优选700μm2的细胞可贴附点阵.优选的，在本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法中，细胞可贴附点阵为圆形。优选的，在本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法中，液体基础培养基为DMEM/F12液体基础培养基。优选的，在本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法中，BM培养体系包括0.5×B27添加剂、0.5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、2mM尼克酰胺、10mM地塞米松、60μg/mL维生素C。优选的，在本专利技术提供的成熟肝细胞的长期体外培养方法中，成熟肝细胞为哺乳动物的成熟肝细胞，优选为小鼠、大鼠或人的成熟肝细胞。与对照组的普通玻片相比，微阵列玻片可以抑制肝细胞在培养表面的铺展、显著降低肝细胞的细胞张力，并且长期维持肝细胞的功能和表型。本专利技术的第三方面提供了根据本专利技术的培养方法获得的成熟肝细胞的应用，如在制备肝脏疾病的治疗细胞、肝脏组织工程、肝脏疾病体外药物筛选中的应用。本专利技术的有益保障及效果如下：通过实验，使用本专利技术以微阵列玻片作为载体的培养方法可以在体外长期培养小鼠成熟原代肝细胞，小鼠原代肝细胞在此条件下可培养超过3周，经过检测，微阵列玻片上培养的肝细胞几乎无应力纤维产生，Alb和Hnf4α等成熟肝细胞的标志物的表达可以得到长期维持，从而实现长期维持肝细胞的功能和表型。附图说明图1是利用微阵列玻片体外长期维持成熟肝细胞的功能和表型。(A、D、E)在微阵列玻片上培养可以通过限制细胞铺展来抑制细胞张力的增加，从而实现肝细胞功能和表型于体外的长期维持；(B和C)作为对照，肝细胞的张力大幅增加，而其功能和表型迅速消退，无法长期维持。具体实施方式现结合实施例对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限于此。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1：成熟肝细胞获取通过两步胶原酶灌注法分离获得C57BL/6雄性和雌性小鼠(上海SLAC实验室)肝细胞：先采用PBS冲洗肝脏，然后依次采用无钙镁离子的Hanks液、质量体积比1％的BSA和质量体积比0.1％的胶原蛋白酶IV(ThermoFisherScientific，Catalog#17104019)进行肝脏灌注；待灌注完成后，将小鼠肝脏切成小块并置于含0.1％胶原蛋白酶IV的DMEM/F12培养基(ThermoFisherScientific)中，于37℃水浴10分钟。之后，将原代肝细胞悬液以50g离心5分钟，收集细胞沉淀将其悬浮于无血清的肝脏培养基中。实施例2：微阵列玻片培养支持物可以于体外长期维持肝细胞功能微阵列玻片(CytooSA)和普通玻片在使用前放置于低吸附6孔板中，并均以含1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被，于4℃保存过夜。其中，微阵列玻片是特殊处理过的玻片，该玻片上包含300-1600μm2的圆形细胞可贴附点阵，而除此之外的其他区域属于细胞无法附着的疏细胞区域，故而细胞被限制在了点阵区域内，无法向外铺展，从而限制了细胞张力的增加。采用BM培养体系将原代肝细胞种植于预先包被的微阵列玻片上，2小时后换液去除未贴壁细胞，之后每天采用BM培养体系换液，直至3周。培养3周后通过细胞免疫化学实验检测成熟肝细胞的表型。实验结果显示在微阵列玻片上培养可以有效限制肝细胞的铺展(图1E)。与对照相比，微阵列玻片上培养的肝细胞几乎无应力纤维产生，Alb和Hnf4α等成熟肝细胞的标志物的表达可以得到长期维持(图1A和1D)；而对照组的应力纤维在培养至1周时即已经明显形成，虽然Hnf4α的表达尚可维持，但Alb的表达则在培养1周时即已消失殆尽(图1B和1C)。以上结果表明，通过利用微阵列玻片这一可以限制细胞扩展从而抑制细胞张力的培养支持物，仅在BM培养体系下便可以于体外长期培养肝细胞并维持其功能和表型。以上已对本专利技术创造的较佳实施例进行了具体说明，但本专利技术创造并不限于所述实施例，熟悉本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成熟肝细胞的长期体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：/nA、采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被微阵列玻片，于4℃保存过夜；/nB、采用不含有基质胶的BM培养体系将原代肝细胞种植于预先包被的所述微阵列玻片上，2小时后换液去除未贴壁细胞，之后每天采用该不含有基质胶的BM培养体系换液，直至3周，/n其中，所述BM培养体系包括液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0-100mM尼克酰胺、0-1mM地塞米松、0-500μg/mL维生素C。/n

【技术特征摘要】
1.一种成熟肝细胞的长期体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、采用含有1％基质胶的DMEM/F12培养基预先包被微阵列玻片，于4℃保存过夜；
B、采用不含有基质胶的BM培养体系将原代肝细胞种植于预先包被的所述微阵列玻片上，2小时后换液去除未贴壁细胞，之后每天采用该不含有基质胶的BM培养体系换液，直至3周，
其中，所述BM培养体系包括液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青链霉素/链霉素、0-100mM尼克酰胺、0-1mM地塞米松、0-500μg/mL维生素C。


2.根据权利要求1所述的成熟肝细胞的长期体外培养方法，其特征在于：
其中，所述微阵列玻片上设置有300-1600μm2的细胞可贴附点阵。


3.根据权利要求2所述的成熟肝细胞的长期体外培养方法，其特征在于：
其中，所述微阵列玻片上细胞可贴附点阵的面积为700μm2。


4.根据权利要求2所述的成熟肝细胞的长期体外培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文林，孙平新，张冠宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31