本发明专利技术公开一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和培养方法。首次揭示一种优化的肝细胞长期培养用的培养基，使用该培养基可长期增殖传代和维持培养人肝细胞，并保持其形态功能。应用本发明专利技术的培养基培养肝细胞，操作简单，成本低廉且安全稳定。所培养和增殖传代获得的人肝细胞，可用于临床细胞移植治疗肝病，还可用作肝病相关机理研究，生物人工肝构建，药物肝毒性和药效、药靶检测等相关基础研究的肝细胞来源或细胞模型，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学和医学领域；更具体地，本专利技术涉及人肝细胞体外长期维持和 增殖传代培养的专用培养基和培养方法。
技术介绍
根据世界卫生组织统计，全球每年有上百万的人死于肝病。中国是一个肝病大国， 仅己型和丙型肝炎病毒带原者就有1. 4亿，约占全球的28%;有29. 7万肝癌患者，占全球的 一半W上（55%)。因此在肝病研究、新药肝毒检测、生物人工肝及肝细胞移植等方面，需要 大量的合格人肝细胞。但肝源缺乏是全球问题，而现有人肝细胞培养方法都存在常规培养 维持其形态功能时间短，非常规培养操作繁杂、要求条件高、干扰因素多、培养时间不够长， 并且都不能增殖传代等缺陷。因此亟待研究新的人肝细胞培养增殖传代方法。 人肝细胞在医药相关领域有极为广泛的应用。长期W来，国内外学者对肝细胞的 培养方法作了大量研究，但在常规培养条件下，长时间培养肝细胞并保持其形态功能的方 法，目前尚未见任何报道。尤其是让肝细胞在体外培养条件下增殖传代，更是难W突破。目 前分离的人肝细胞在体外常规培养最长可达14天，其它方法如共生培养、悬浮培养、H明 治培养、H维培养等最长可W培养肝细胞到3个月。但由于干扰因素多（如共生培养）、操 作繁杂（H明治培养）、或者不能直接观察细胞的形态改变（悬浮培养和H维培养）等送样 郝样的缺陷而无法满足肝病研究的需要，因此仅部分用于检测新药物的肝毒性。然而，即使 用于检测新药物的肝毒，由于存在上述各种缺陷，所得结果也仅有相对的意义和价值。更大 的问题是，上述现有人肝细胞培养方法，都不能增殖传代。因此，现有方法及所培养肝细胞 不仅不能作为肝病研究的合格细胞模型，更不可能为构建生物人工肝及肝细胞移植提供合 格的肝细胞来源。 综上，本领域还有必要开发新型的人肝细胞长期维持和增殖传代培养的培养方法 及专用培养基。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养的专用培养基和 培养方法。 在本专利技术的第一方面，提供一种用于培养人肝细胞的培养基，所述的培养基包括： 肝细胞基本培养基；W及GSK3 目抑制剂CHIR99021 ;0. 5-10UM;TGF目抑制剂SB431542 ;0. 5-10UM或 / 和TGF目抑制剂A83-01 ;0. 5-10UM。 在一个优选例中，所述培养基中包括： GSK3 目抑制剂CHIR99021 ;l-4yM;[001引TGF目抑制剂SB431542 ;l-8yM或 / 和 [001引TGF目抑制剂A83-01 ;l-8uM。 在另一优选例中，所述培养基中还包括选自下组的成分：[001引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0. 25-25mM;[001引 制瘤素M(OSM) ;l-100ng/ml;或 / 和 白血病抑制因子OJ巧；100-1000u/ml。 在另一优选例中，所述培养基中包括：[001 引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0.S-I2.SmM; 制瘤素M(OSM) ;5-80ng/ml;或 / 和 白血病抑制因子OJ巧：150-800u/ml。 在另一优选例中，所述培养基中还包括选自下组的成分： 人襲凌细胞生长因子 5-! 0化巧/!地 人戒纤维细臘生长閨子 5-K)0ng/m; 人沉细嫩生长:因子 5 -U)0ng/mH 地蠢米松 血小板衔化因子 M00ng./ml; H礫甲状腺原魏驗 MOOng/mlo 在另一优选例中，所述培养基中： 乂表皮细蔽生长闲r 5-5谢m!， 人成巧维綱胞化长树于 5~撕鸣/!化[; 人针细跑生眨詞rS-SOng/mlt 地撫米松 04-咏為感1; !虹小板.衔生因r 5-50ng/m!； 鱗巧状腺爆毁酸 20-80t墙mL 在另一优选例中，所述的肝细胞基本培养基是在基础细胞培养基中添加了 2. 5% 肥、5%827、1%非必须氨基酸、1%丙丽酸钢和青链霉素混合液（100讶；或者添加入；5%肥 或10%B27U%非必须氨基酸、1 %丙丽酸钢和1 %青链霉素（100讶等成分得到的培养基。 或直接使用基础细胞培养基替代肝细胞基本培养基。所述基础细胞培养基为DMEM/F12、 MEM、DMEM、RPMI1640、Neurona化asal或Fischers等，均为市场上可购得的商品。 在本专利技术的另一方面，提供一种用于培养人肝细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包 括前面任一所述的培养基。 在本专利技术的另一方面，提供所述的培养基或所述的试剂盒的用途，用于维持和增 殖传代培养人肝细胞。 在本专利技术的另一方面，提供一种维持和增殖传代培养肝细胞的方法，所述方法包 括；应用前面任一所述的培养基培养肝细胞。较佳地，所述的培养肝细胞的方法包括： (1)将培养板打底（较佳地，用基质胶、鼠尾胶、明胶、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋 白其中一种打底）1-24小时，然后将原代肝细胞在贴壁培养基（较佳地，为添加10%血清的 肝细胞基本培养基）中混悬，铺板；37C培养1-12小时； (2)弃用（1)中的培养基，将肝细胞分别换入权利要求1-5任一所述的培养基中培 养。 在另一优选例中，前面所述的培养基、试剂盒、用途或方法中，所述的人肝细胞包 括但不限于；人原代肝细胞及其传代肝细胞，从干细胞分化所得的人肝细胞或成体细胞转 化所得的人肝细胞。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。【附图说明】 图1、人原代肝细胞在不同条件培养下，第1，14和20天拍摄的细胞形态图。 图2、肝细胞培养基I-2. 1培养14天的体外培养的细胞形态图。 图3、肝细胞培养基I-3. 4培养21天的体外培养的细胞形态图。 图4、肝细胞培养基I-3. 1培养35天的体外培养的细胞形态图。 图5、肝细胞培养基I-3. 2传代培养第二代，共培养56天的细胞形态图。 图6、肝细胞培养基I-3. 3传代培养第二代，共培养80天的细胞形态图。 图7、肝细胞培养基I-2. 2传代培养第H代，共培养110天的细胞形态图。 图8、肝细胞培养基I-2. 2传代培养的肝细胞形态图。 图9、肝细胞培养基I-1.1/2与I-2. 1/2培养人原代肝细胞，在培养至第 20天时获得的细胞形态图。其中，"2个核必因子"是指"CHIR99021+SB431542"或 "CHIR99021+A83-01"。 图10、肝细胞培养基I-2. 2培养84天肝特异性标志物的免疫染色。 图11、肝细胞培养基I-2. 1培养77天肝系相关基因的表达。 图12、肝细胞培养基I-3. 1培养11周的P450酶诱导功能实验结果。 图13、肝细胞培养基I-3. 1培养11周的肝细胞糖原染色。【具体实施方式】 本专利技术人经过长期而深入的研究，掲示了一种人肝细胞长期维持和增殖传代培养 的培养基W及培养方法。所述方法克服了现有肝细胞培养方法的缺陷，可在常规条件下长 期维持培养人肝细胞并使其增殖传代，且保持与新分离的人原代肝细胞基本一致的形态功 能。所述方法培养条件简单，成本低廉且安全稳定。[004引如本文所用，术语"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……构成（制成）"、 "基本上由......构成"和"由......构成"。 培养基 本专利技术人提供了用于进行人肝细胞培养的培养基。所述的培养基包括；GSK3目本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于培养人肝细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：肝细胞基本培养基；以及GSK3β抑制剂CHIR99021：0.5‑10μM；TGFβ抑制剂SB431542：0.5‑10μM或/和TGFβ抑制剂A83‑01：0.5‑10μM。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张培霖，王红阳，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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