一种带叶兜兰的组织培养快速繁殖方法技术

本发明专利技术提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：(1)自交授粉；(2)果荚采摘；(3)无菌播种；(4)增殖继代培养；(5)生根壮苗培养；(6)生根苗移栽。本发明专利技术还提供了一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，包括萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其可用于上述带叶兜兰组培快繁方法中。本发明专利技术另外还提供了带叶兜兰果荚的最佳采摘期，即在带叶兜兰自交后120‑195天左右采摘果荚。通过本发明专利技术的方法培养的种苗萌发率高、健壮、根系发达、生长周期短，同时，本发明专利技术的方法简单易操作，生产成本低，为带叶兜兰商业化生产提供了很好的基础。

Tissue culture rapid propagation method with leaf orchid

The present invention provides a Paphiopedilum tissue culture and rapid propagation, which comprises the following steps: (1) self pollination; fruit picking; (2) (3) (4) the proliferation of aseptic seeding; subculture; rooting; (5) (6) rooting plantlets. The invention also provides a method for Paphiopedilum with tissue culture and rapid propagation medium system, including germination medium, proliferation culture medium and rooting medium, which can be used for the Paphiopedilum micropropagation method. The invention also provides with Paphiopedilum pod picking the best period, namely in the leaves of Paphiopedilum about 195 days after the 120 self picking pods. By the method of seedling cultivation of high germination rate, robust, developed root system, short growth cycle, at the same time, the method of the invention is simple and easy to operate, low production cost, provide a good foundation for commercial production with paphiopedilum.

【技术实现步骤摘要】
一种带叶兜兰的组织培养快速繁殖方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体而言，本专利技术涉及一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及一种确定带叶兜兰果荚最佳采集期的方法。
技术介绍
兜兰属(Paphiopedilum)是兰科最原始的属之一。与一般的兰花比较，兜兰属植物花的结构有巨大的变化，唇瓣呈半椭圆形的兜状，形状很特别，故名兜兰；又因其形状酷似旧时欧洲少女的拖鞋，又名拖鞋兰。但是由于近年来日益恶劣的生态环境、自身特殊的生物学特性以及人们的过度性采挖，兜兰植物现已成为世界上濒危的植物物种之一，许多种类已濒临灭绝，所有兜兰野生种均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录I而被禁止交易(卢思聪,《中国兰与洋兰》,金盾出版社,1994；郎楷永,“中国的兜兰”,《科技导报》,2002,20(9):56+2+65-66；曾宋君等，“兜兰无菌播种和组织培养研究进展”,《园艺学报》,2007,34(3):793-796)。因此兜兰属植物的保护工作以及繁育研究越来越受到人们的重视。带叶兜兰(Paphiopedilumhirsutissimum(Lindl.exHook.))原产我国广西、贵州、云南等地，越南、老挝和泰国也有分布。叶片亮绿如带，花大且花期长，在野外常常成丛成片分布。在引种的过程中，发现与其它兜兰相比，带叶兜兰适应性强、生长快、自我繁殖能力强、观赏价值高，具有很高的应用前景。和其他兰花一样，带叶兜兰种子没有胚乳，野外与真菌共生才能萌发。兰花主要靠组培苗进行繁殖，其组培苗的数量约占观赏植物组培苗总量的40％(熊丽等,《观赏花卉的组织培养与大规模生产》,化学工业出版社,2003)。但是，兜兰的组织培养技术难度极大(王代谷等，“贵州兜兰属植物的现状及展望”,《安徽农业科学》,2009,37(6):2469-2470)，是兰科中最难的属之一。随着组织培养技术的发展和研究的深入，近几年取得了一定的进展，但是通过组织培养技术进行兜兰的商业化大规模生产的技术路线仍未达到十分成熟。如何以简便易行的操作技术进行低成本的大规模生产对挽救濒临灭绝的带叶兜兰及其开发利用具有重要意义。因此，有必要提供一种带叶兜兰的快速繁殖体系，以缩短其培养周期、提高种苗成活率和幼苗质量、降低成本，从而满足市场对这一观赏花卉不断增长的需求。
技术实现思路
为了解决上述问题和克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及提供了带叶兜兰果荚的最佳采集期。本专利技术的第一方面提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：(1)自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；(2)果荚采摘：在带叶兜兰自交后120-195天左右采集果荚；(3)无菌播种：以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养大约40-50天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养；(4)增殖继代培养：将步骤(3)中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍；(5)生根壮苗培养：将步骤(4)中增殖培养大约8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养；(6)生根苗移栽：在步骤(5)中的幼苗培养大约4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养。在一个优选的实施方式中，在本专利技术的方法中使用的所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/LNAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个实施方式中，在本专利技术的方法中使用的所述增殖培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个实施方式中，在本专利技术的方法中使用的所述生根壮苗培养基的成分及其含量与上述增殖培养基一样，即所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个优选的实施方式中，在带叶兜兰自交后第100天左右、第120天左右、第150天左右、第165天左右、第195天或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。例如，可以在带叶兜兰自交后第100天左右、第105天左右、第110天左右、第115天左右、第120天左右、第125天左右、第130天左右、第135天左右、第140天左右、第145天左右、第150天左右、第155天左右、第160天左右、第165天左右、第170天左右、第175天左右、第180天左右、第185天左右、第190天左右、第195天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。优选地，在带叶兜兰自交后第第100天左右到第120天左右、第120天左右到第135天左右、第120天左右到第150天左右或第120天左右到第165天左右的时间段采摘果荚，更优选地在带叶兜兰自交后第120天左右到第135天左右采摘果荚。优选地，在带叶兜兰自交后120天左右、135天左右、150天左右或165天左右采集果荚，更优选地在带叶兜兰自交后第120天左右采摘果荚。在一个实施方式中，在本专利技术的方法中，培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。本专利技术的第二方面提供了一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的萌发培养基，所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/LNAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。本专利技术的第三方面提供了一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/LNAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个实施方式中，本专利技术的培养基体系中的所述增殖培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个优选的实施方式中，本专利技术的培养基体系中的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。在一个优选的实施方式中，本专利技术的培养基体系是下面表1所示的培养基体系，表1列出了本专利技术培养基体系中的各种培养基的成分及其用量。表1.带叶兜兰的离体培养基体系注：表1中的生根壮苗培养基，既可作为一般生根壮苗培养基，也是本专利技术所指的可用来做长期继代的培养基。定义为了便于对本专利技术的理解，对上述各个方面中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素进行定义。本专利技术所使用的MS基本培养基是根据MurashigeT.等(MurashigeT.andF.Skoog.Physiol.Plan本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

【技术特征摘要】
1.一种用于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/LNAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。2.如权利要求1所述的培养基体系，其中所述增殖培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。3.如权利要求1-2任一项所述的培养基体系，其中所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。4.一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：(1)自交授粉：选择花大色艳的带叶兜兰进行异花授粉；(2)果荚采摘：在带叶兜兰自交后120-195天采集果荚；(3)无菌播种：以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中进行暗培养大约40-50天，待30％种子长出原球茎，转为光照周期为12h培养；(4)增殖继代培养：将步骤(3)中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍；(5)生根壮苗培养：...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾瑞冬，葛红，李秋香，张晓，周妍慧，徐玉凤，刘娜，王洪云，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11