本发明专利技术提供一种促进肝细胞miR‑199b高表达的慢病毒表达载体，包括pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿色荧光基因的Pri‑miRNA‑199b序列产物；所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri‑miRNA‑199b序列产物正向插入所述多克隆位点序列中。本发明专利技术属于基因工程技术领域，本发明专利技术提供的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地提高miRNA‑199b表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体及其构建方法。
技术介绍
miRNA是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参与基因调控。miRNA主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的mRNA或抑制不完全配对的mRNA翻译，具有非常重要的生物学作用。miRNA是在细胞核内DNA聚合酶II作用下由DNA转录成为初级miRNA(pri-miRNA)。miRNA在核内酶RNase III-Drosha的作用下加工剪切为六七十个核苷酸序列的发夹结构前体pre-miRNA，然后再依赖RNA的核转运受体家族成员输出蛋白Exportin-5的作用下转运到胞浆。在胞浆RNase III Dicer酶作用下二次加工为单链的成熟miRNA，与RNA诱导沉默复合物结合形成RISC，识别靶mRNA后抑制其翻译或通过去腺苷酸化和脱帽作用致使mRNA降解。通过miRNA靶基因预测软件查找能与SET基因3’-UTR互补结合的miRNAs，包括miRNA-23a，miRNA-21，miRNA-199b，miRNA-20a，miRNA-29b，miRNA-194，miRNA-221，miRNA-129等。现有研究中已发现miR-199b在肝癌中异常低表达且与病人预后密切相关。李卫华等人将miR-199b片段转染至尤文肉瘤细胞中，但利用的是脂质体瞬时转染而并非稳定转染，质粒会随着细胞增殖而逐渐丢失。因此对于miR-199b在肝细胞中的功能研究受到限制。目前尚未见在人源肝细胞中持续、稳定且高效表达miR-199b的重组载体。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，通过将含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地提高miRNA-199b表达。本专利技术中，miR-199b指miRNA-199b。本专利技术提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，包括pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物；所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物正向插入所述多克隆位点序列中。采用上述技术方案，本专利技术提供的含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体构建得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可持续、高效、稳定地提高miRNA-199b表达，可应用于制备治疗miRNA-199b表达异常相关疾病药物的开发中。优选地，所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物通过PCR扩增获得，以Pri-miRNA-199b重组质粒为模板，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：2。采用上述模板和PCR引物，通过PCR可以扩增出含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列，减少了序列合成费用，成本较低且便于观察检测转染效率。更优选地，所述Pri-miRNA-199b重组质粒包括pCI MammaLian Expression Vector表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Pri-miRNA-199b序列；所述多克隆位点包括EcoRI酶切位点和Kpn I酶切位点，所述Pri-miRNA-199b序列正向插入所述多克隆位点序列中。进一步优选地，所述Pri-miRNA-199b序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即SEQ ID NO：3，所述下游引物的序列为：GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：4。通过PCR扩增，引进了EcoRI和KpnI两个特异性酶切位点。本专利技术提供的上游引物和下游引物均无引物二聚体，且上游引物和下游引物的退火温度差距较小。相应地，本专利技术还提供一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：S1：Pri-miRNA-199b的引物设计：通过miRBase库找到与SET基因关联的miRNA-199b基因的Pri-miRNA序列，并引进EcoR I和Kpn I特异性酶切位点，设计上游引物为：GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即SEQ ID NO：3；下游引物为：GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：4；上述引物通过PCR扩增得到的产物包含EcoR I和Kpn I特异性酶切位点；S2：Pri-miRNA-199b序列的获得：提取人肝细胞总RNA后，利用RNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，并用步骤S1中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得Pri-miRNA-199b序列；S3：Pri-miRNA-199b重组质粒的获得：pCI MammaLian Expression Vector载体经改造在Xho I和EcoR I位点插入了Zsgreen-绿色荧光基因后，和步骤S2获得的Pri-miRNA-199b基因序列分别经EcoR I和Kpn I限制性内切酶双酶切后，T4 DNA连接酶连接得到连接产物，将该连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明Pri-miRNA-199b序列插入成功的菌液进行测序鉴定，将测序鉴定正确的大肠杆菌培养并抽提，得到含Pri-miRNA-199b序列的Pri-miRNA-199b重组质粒；S4：含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物的获得：以步骤S3得到的Pri-miRNA-199b重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：2，得到含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物；S5：促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建：将pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体用Nhe I和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，T4DNA连接酶将步骤S4获得的含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体，得到重组慢病毒表达载体。优选地本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进肝细胞miR‑199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿色荧光基因的Pri‑miRNA‑199b序列产物；所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri‑miRNA‑199b序列产物正向插入所述多克隆位点序列中。
【技术特征摘要】
1.一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：包括pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物；所述多克隆位点序列包括Nhe I酶切位点和BamH I酶切位点，所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物正向插入所述多克隆位点序列中。2.根据权利要求1所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：所述含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物通过PCR扩增获得，以Pri-miRNA-199b重组质粒为模板，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：CTAGCTAGCATGGCCCAGTCCAAGCAC，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：CGGGATCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：2。3.根据权利要求2所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：所述Pri-miRNA-199b重组质粒包括pCI MammaLian Expression Vector表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和Pri-miRNA-199b序列；所述多克隆位点包括EcoR I酶切位点和Kpn I酶切位点，所述Pri-miRNA-199b序列正向插入所述多克隆位点序列中。4.根据权利要求3所述的促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体，其特征在于：所述Pri-miRNA-199b序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即SEQ ID NO：3，所述下游引物的序列为：GGGGTACCCCATCCTCTCAGTCTTCCTC，即SEQ ID NO：4。5.一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：Pri-miRNA-199b的引物设计：通过miRBase库找到与SET基因关联的miRNA-199b基因的Pri-miRNA序列，并引进EcoR I和Kpn I特异性酶切位点，设计上游引物为：GGAATTCACAGACACTGCTGCCTGGAT，即SEQ ID NO：3；下游引物为：GGGGTAC...
【专利技术属性】
技术研发人员：任晓虎，刘建军，黄新凤，钟佳成，阮嘉雯，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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