一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法技术

技术编号:24882267 阅读:31 留言:0更新日期:2020-07-14 18:08
本发明专利技术属于细胞培养技术领域,具体涉及一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法。本发明专利技术提供的CD90posi细胞的培养基,在基础培养基DMEM/F‑12中加入由PD‑1抑制剂与苦参碱按7:3重量比组成的细胞生长抑制剂,由松茸提取物和刺五加提取物按3:2重量比组成的突变抑制剂;采用三维培养的方法培养CD90posi细胞。采用本发明专利技术提供的培养基培养CD90posi细胞具有以下优点:细胞不易聚集成团,培养速度易于控制,同时,还能保证培养过程中细胞的活性,且不会出现在培养过程中细胞继续发生突变的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法
本专利技术属于细胞培养
,具体涉及一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法。
技术介绍
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高、死亡率高,病死率位居国内肿瘤第二位,严重威胁人民群众的生命健康。肝癌起病隐匿,临床表现缺乏特别性,就医时往往处于肝癌中晚期,肝癌早期患者难以发现,严重影响肝癌的治疗效果。目前肝癌的临床检测手段主要通过检测患者血清甲胎蛋白(AFP)并结合影像学检查进行确诊,可分为以下几类:B超检查受肠气及周围脏器的影响,分辨率低,B超引导下进行肝脏病灶穿刺活检存在一定假阴性率;同时肝脏穿刺存在创面出血、针道转移等严重并发症。CT或MR仅能分辨直径1.0cm以上的病灶,且有一定的假阳性率与假阴性率。DSA技术虽可提高肝癌检测的准确率,但为侵入性检查,多用于肝癌治疗。由于血清AFP显著升高一般出现在肿瘤进展期,且阳性率仅为60-70%,在准确率、检测效率、诊断扰动后对病人治疗风险性和诊断时间的滞后等方面都有明显的局限性,开发新的检测手段有其重要性与迫切性。中国专利申请CN108872603A公开了一种用于肝癌干细胞的鉴定方法,这种方法虽然可以保证标志物蛋白的稳定表达,且表达量与LCSC细胞含量呈现出良好的线性关系,实现LCSC细胞含量的相对定量分析;然而,并没有解决现有肝癌细胞如何大量获取的过程,只有实现肝癌细胞的体外大量增殖,才能更好的对其进行分析。综上所述,现有技术中,缺少培养肝癌细胞的有效方法,而采用现有培养基培养肝癌细胞具有容易聚集成团,不易控制,易发生突变等缺点。在对肝细胞癌微环境细胞群的分析中,我们筛选出CD90posi肿瘤细胞,发现CD90posi细胞促进肝癌细胞的增殖、迁移。同时CD90posi细胞表现出很强的增殖潜力和细胞干性。将CD90posi肝癌细胞注射于裸鼠皮下,发现随着CD90posi细胞所占比例增加,移植的肿瘤体积和重量越大,表明CD90posi细胞是肝细胞癌增殖和生长的关键因素。
技术实现思路
针对现有技术普遍存在的缺点,本专利技术提供了一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法。采用本专利技术提供的培养基培养CD90posi细胞不易聚集成团,培养速度易于控制,同时,还能保证培养过程中细胞的活性,且不会出现在培养过程中细胞继续发生突变的问题。为了达到上述目的,本专利技术采用的技术方案为:一种培养CD90posi细胞的培养基,包含如下组分及其重量百分数:DMEM/F-12基础培养基94~97.5%,细胞生长抑制剂0.5~3%,突变抑制剂2~3%。优选地,所述的培养CD90posi细胞的培养基,由如下组分及其重量百分数组成:DMEM/F-12基础培养基96%,细胞生长抑制剂1.5%,突变抑制剂2.5%。优选地,所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比6~8:2~4组成;所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比2~4:1~3组成。优选地,所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比7:3组成;所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3:2组成。本专利技术还提供了一种利用所述培养基培养CD90posi细胞的方法,包括如下步骤:S1、于无菌条件下,切取新鲜的肝癌组织,培养两代后,利用免疫磁珠间接标记分离法分离CD90posi细胞,得CD90posi细胞;S2、用matrigel母液消化步骤S1所得CD90posi细胞,然后重悬于所述的培养基中,全程置于冰上处理,收集所述细胞悬液,得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液;S3、将步骤S2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1~2:3~5混合均匀,置于34~37℃,放置35~45min,使其成胶;得胶状混合培养物;S4、向步骤S3所得胶状混合培养物中加入所述的培养基,置于36℃,3%的CO2培养箱中孵育,24h换液一次,培养,即得。优选地,步骤S1所述免疫磁珠间接标记分离法分离CD90posi细胞的具体过程为:(1)将冻存的肝癌组织从-80℃冰箱中取出,置于37℃的温度下复温,然后用PBS冲洗,于1600rpm的转速下离心5min,收集上清液,重复洗2遍,然后加入15mL的DMEM/F12+10%PBS培养液,轻轻吹打,重悬细胞使其分散均匀后转入100mL培养瓶中在37℃,5%的CO2环境下培养,待细胞铺满瓶底80%进行传代培养,得原代培养细胞;(2)用0.25%的胰蛋白酶消化步骤(1)所得原代培养细胞,倒置显微镜下观察到细胞脱离瓶底后用胶头吸管将贴壁细胞吹下,加入适量FBS终止消化后转入离心管中,加入PBS除去残余酶,于1600rpm的转速下离心5min,去除上清液,用1mL的培养液重悬,充分混匀后,加入培养瓶中,继续加入5mL培养液,于37℃,5%的CO2环境下培养,得传代培养细胞;(3)用0.25%的胰蛋白酶消化步骤(2)所得原代培养细胞,充分吹打制备单细胞悬液,于1600rpm的转速下离心5min,去除上清液,以10mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞,然后用针管吸取细胞悬液后快速推出以将粘聚成团的细胞分散,加入1mL的Anti-HumanCD90PE抗体,混匀后,于4℃,避光孵育30min,每10min取出摇匀一次,用磷酸盐缓冲液冲洗两次,除去未与一抗结合的细胞,于1600rpm的转速下离心5min,去除上清液,加入2mL的Anti-PEMicrobed抗体,同样于4℃,避光孵育30min,磷酸盐缓冲液冲洗两次,除去未与二抗结合的细胞,加入1mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞,将MS分选柱置入固定于分选器上的磁场中,先以1mL的磷酸盐缓冲液润柱,然后用移液枪将细胞悬液缓慢加入分选柱中,取离心管于磁柱下承接分选得到的CD90posi细胞,待细胞悬液通过磁柱后,加入1mL磷酸盐缓冲液,冲洗磁珠,使细胞全部脱离磁柱,加入2mL磷酸盐缓冲液,并用配套的活塞快速将磁柱中结合的CD90posi细胞充入离心管中,于1600rpm的转速下离心5min,去除上清液,即得。优选地,步骤S2所述的matrigel母液的质量浓度为9~10mg/mL。优选地,步骤S3所述的matrigel溶液的质量浓度为10~11mg/mL。本专利技术中,在培养CD90posi细胞时,向培养基中加入由PD-1抑制剂与苦参碱按一定比例组成的细胞生长抑制剂,这样可以有效抑制癌细胞的无限生长,使得癌细胞的体外培养速度可以受控;同时,本申请中还加入了由松茸提取物和刺五加提取物按一定比例组成的突变抑制剂,防止CD90posi细胞在培养过程中突变,以提高细胞培养纯度;而在培养CD90posi细胞的过程中,采用三维培养方法,这样更接近于体内环境,保持癌细胞的增殖、分化能力,有助于人们模拟体内环境,对肝癌细胞的进一步深入研究。此外,申请人还意外发现,将细胞生长抑制剂与突变抑制剂同时加入培养基中,可以有效避免CD90pos本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种培养CD90posi细胞的培养基,其特征在于,包含如下组分及其重量百分数:DMEM/F-12基础培养基94~97.5%,细胞生长抑制剂0.5~3%,突变抑制剂2~3%。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养CD90posi细胞的培养基,其特征在于,包含如下组分及其重量百分数:DMEM/F-12基础培养基94~97.5%,细胞生长抑制剂0.5~3%,突变抑制剂2~3%。


2.如权利要求1所述的培养CD90posi细胞的培养基,其特征在于,由如下组分及其重量百分数组成:DMEM/F-12基础培养基96%,细胞生长抑制剂1.5%,突变抑制剂2.5%。


3.如权利要求1或2所述的培养CD90posi细胞的培养基,其特征在于,所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比6~8:2~4组成;所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比2~4:1~3组成。


4.如权利要求3所述的培养CD90posi细胞的培养基,其特征在于,所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比7:3组成;所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3:2组成。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述培养基培养CD90posi细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、于无菌条件下,切取新鲜的肝癌组织,培养两代后,利用免疫磁珠间接标记分离法分离CD90posi细胞,得CD90posi细胞;
S2、用matrigel母液消化步骤S1所得CD90posi细胞,然后重悬于权利要求1-4任一项所述的培养基中,全程置于冰上处理,收集所述细胞悬液,得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液;
S3、将步骤S2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1~2:3~5混合均匀,置于34~37℃,放置35~45min,使其成胶;得胶状混合培养物;
S4、向步骤S3所得胶状混合培养物中加入权利要求1-4任一项所述的培养基,置于36℃,3%的CO2培养箱中孵育,24h换液一次,培养,即得。


6.如权利要求5所述培养CD90posi细胞的方法,其特征在于,步骤S1所述免疫磁珠间接标记分离法分离CD90posi细胞的具体过程为:
(1)将冻存的肝癌组织从-80℃冰箱中取出,置于37℃的温度下复温,然后用PBS冲洗,于1600r...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘建平苏正张克幍
申请(专利权)人:中山大学孙逸仙纪念医院
类型:发明
国别省市:广东;44

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