一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用，通过无血清培养基和微载体筛选，获得适合肝癌细胞系Huh‑7规模化无血清贴壁培养条件，通过驯化培养建立适合规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系。本发明专利技术建立的细胞系可用于疫苗等生物制品的无血清制备。

A hepatoma cell line adapted to large-scale serum-free adherent culture and its establishment and Application

【技术实现步骤摘要】
一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用。
技术介绍
随着生物医药技术的快速发展，细胞培养技术广泛应用于生物制品领域。细胞培养技术中使用的培养基既是供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基按其来源分为天然培养基和合成培养基，其中天然培养基最常用的是牛血清。血清中含有细胞生长因子、促贴附因子等多种细胞生长所必需的多活性物质。目前使用最普遍的培养基是添加了牛血清的M199、DMEM、MEM等合成的基础培养基。但由于血清成分复杂和存在生物风险等因素，无血清培养已成为生物制品生产的趋势。另外，现行的生产工艺中还存在产量低、纯化困难等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对现有技术中存在的不足，提供一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系及其建立方法和应用。本专利技术采用的技术方案如下：一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系的建立方法，包括：复苏Huh-7细胞并用含8-12％FBS的DMEM培养基进行培养；待细胞长满后，用胰酶消化传代，再用含3-7％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，再用含1-2％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，最后用CDBHK-21无血清培养基培养即得或用CDBHK-21无血清培养基重悬后加入Cytodex1微载体培养即得。>进一步地，复苏Huh-7细胞并用含10％FBS的DMEM培养基进行培养；待细胞长满后，用胰酶消化传代，再用含5％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，再用含2％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，最后用CDBHK-21无血清培养基培养即得或用CDBHK-21无血清培养基重悬后加入Cytodex1微载体培养即得。进一步地，用CDBHK-21无血清培养基进行传代培养时，传代比例为1：2-4。进一步地，用CDBHK-21无血清培养基进行传代培养时，传代比例为1：3。上述的方法建立的肝癌细胞系。上述的适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系在表达外源蛋白中的应用。上述的适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系在制备疫苗中的应用。上述的适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系在制备病毒载体中的应用。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过CDBHK-21无血清培养基和Cytodex1微载体筛选，将需要血清培养的肝癌细胞系Huh-7驯化成适合规模化无血清贴壁生长的细胞肝癌细胞系，适用于细胞工厂培养模式以及生物反应器结合微载体培养模式，操作方法简单，驯化效果良好；2、本专利技术首先将复苏并用含10％FBS的DMEM培养基培养，再用含5％FBS的DMEM培养基培养，再用含2％FBS的DMEM培养基培养，最后用CDBHK-21无血清培养基培养或用CDBHK-21无血清培养基重悬后加入Cytodex1微载体培养，在整个驯化培养过程中，逐步降低血清的浓度，逐渐让细胞适应低血清直至无血清的生长，避免细胞突然在无血清的条件下不适应导致死亡；整个驯化过程顺畅，相对于传统驯化方法及其他降低梯度驯化方法，本专利技术在每个血清梯度对应的细胞长满后，用胰酶消化传代继续培养，无需多次传代，整体控制驯化周期在21天内完成，显著缩短驯化周期，节省驯化成本，以利于于后续的工业化大规模生产；3、本专利技术所使用的无血清培养基不含动物血清，成本低，生物风险低，提高了培养的稳定性，简化了后期纯化过程；4、本专利技术所使用的微载体结合无血清培养基培养，拓展了本专利技术的应用场景，通过表面积/体积比大的微载体，提高了对培养基的利用率，提供更均一的生长环境；5、本专利技术的Huh-7SF细胞系的贴壁效果好，形态饱满，大小均一，增殖速度快，活性大，感染率高，适于规模化生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1获得的细胞状况图；图2为Huh-7SF细胞进行体外增殖的生长状况图；图3为Huh-7SF和Huh-7细胞生长曲线图；图4为Huh-7SF和Huh-7细胞生长状况图；图5为Huh-7SF与Huh-7细胞成瘤性对比图；图6为基因修饰(重组腺病毒感染)2h辐照200Gy的Huh-7SF细胞小鼠成瘤情况图；图7为基因修饰(重组腺病毒感染)2h未辐照的Huh-7SF细胞小鼠成瘤情况图；图8为未基因修饰(重组腺病毒未感染)辐照200Gy的Huh-7SF细胞小鼠成瘤情况图；图9为未基因修饰(重组腺病毒未感染)未辐照的Huh-7SF细胞小鼠成瘤情况图；图10为Huh-7用AIM-V培养基在方瓶或细胞工厂中培养的形态图；图11为Huh-7用CP-SFM培养基在方瓶或细胞工厂培养的形态图；图12为Huh-7用CDBHK-21培养基在方瓶或细胞工厂的形态结果图；图13为VirusPro培养基培养24h和96h的Huh-7细胞在微载体上的形态；图14为VP-SFM培养基培养24h和96h的Huh-7细胞在微载体上的形态；图15为CDBHK-21培养基培养24h和96h的Huh-7细胞在微载体上的形态；图16为X-VIVO培养基培养24h和96h的Huh-7细胞在微载体上的形态；图17为Huh-7SF在微载体Cytodex1上的细胞形态图；图18为Huh-7SF在微载体Cytodex3上细胞形态图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术，即所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本专利技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施例。基于本专利技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括：/n复苏Huh-7细胞并用含8-12％FBS的DMEM培养基进行培养；待细胞长满后，用胰酶消化传代，再用含3-7％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，再用含1-2％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，最后用CDBHK-21无血清培养基培养即得或用CDBHK-21无血清培养基重悬后加入Cytodex1微载体培养即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括：
复苏Huh-7细胞并用含8-12％FBS的DMEM培养基进行培养；待细胞长满后，用胰酶消化传代，再用含3-7％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，再用含1-2％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，最后用CDBHK-21无血清培养基培养即得或用CDBHK-21无血清培养基重悬后加入Cytodex1微载体培养即得。


2.根据权利要求1所述的适应规模化无血清贴壁培养的肝癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括：
复苏Huh-7细胞并用含10％FBS的DMEM培养基进行培养；待细胞长满后，用胰酶消化传代，再用含5％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，再用含2％FBS的DMEM培养基培养；待细胞长满后，继续用胰酶消化传代，最后用CDBHK-21无...

【专利技术属性】
技术研发人员：程平，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51