一种人神经干细胞细胞库的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种人神经干细胞细胞库的构建方法，其步骤具体如下：步骤一：采集人神经干细胞；步骤二：原代细胞的培养、鉴定原代神经干细胞、原代细胞的传代及部分冻存；步骤三：神经干细胞纯化、传达及扩大培养；步骤四：鉴定神经干细胞、程序降温及编码入库。本发明专利技术步骤操作简单，获取、培养、冻存的人神经干细胞纯度高、增殖能力强、复苏效率高、解决了神经干细胞制备生产、保存等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种人神经干细胞细胞库的构建方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种人神经干细胞细胞库的构建方法。
技术介绍
神经干细胞是一类具有多方向分化潜能的干细胞，能够长期自我更新，且在一定条件下可分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞含有巢蛋白和Musashi蛋白，该蛋白作为神经干主要标志物，从而标志和鉴定神经干细胞。在体外分离、培养得到神经干下细胞为Nestin和Musashi蛋白双阳性。神经干细胞由于自身特点，丰富治疗颅内疾病的有效治疗手段，特别是在治疗帕金森病、阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、缺血性脑损伤等方面有着独有优势。因此，我们提出一种人神经干细胞细胞库的构建方法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种人神经干细胞细胞库的构建方法，可以有效解决
技术介绍
中的问题。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种人神经干细胞细胞库的构建方法，其步骤具体如下：步骤一：采集人神经干细胞；步骤二：原代细胞培养、鉴定原代神经干细胞、原代细胞的传代及部分冻存；步骤三：神经干细胞纯化、传达及扩大培养；步骤四：鉴定神经干细胞、程序降温及编码入库。进一步的，步骤一的原代神经干细胞的来源为哺乳类神经干细胞，所述原代神经干细胞为手术分离废弃脑组织，包括额叶皮层、中脑及海马区脑组织，眼科反复切割，在DEME/F12(体积比：1:1)漂洗，过200目滤网，离心获得原代神经干细胞悬液。进一步的，步骤二用无血清培养基和培养工艺消化计数后，进行重悬，并调整密度1×105个/ml，在超低吸附培养液中，置于37℃，5％CO2中环境中进行培养。其中，无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF，EGF，LIF组成，无任何动物血清成分。进一步的，步骤三将扩增满的原代神经干细胞进行消化、传代、直至传代到第5代，并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞，将种子细胞按照程序降温进行冻存，便于保存，当扩增原代细胞直径超过300μm时，然后进行消化传达至P1代神经干细胞；P1代神经干细胞消化后接种至超低吸附培养瓶中，放入37℃，5％CO2的环境中进行培养至传代，重复消化，接种、培养到P5代神经干细胞；将P5代神经干细胞进行细胞特性和异源物质检测，细胞特性鉴定包括流式鉴定和免疫荧光，流式细胞鉴定神经干细胞表面标记物Nestin、Musashi，检测其纯度95％以上，荧光免疫的方法鉴定神经干细胞的分化特性，即神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞分化结果，异源物质主要是微生物的检测，包括无菌检测，支原体检测和内毒素检测，其结果阴性为合格，检测合格后将细胞冻存作为种子细胞。进一步的，步骤四将种子细胞，计数并无血清培养基悬浮培养，待培养瓶细胞融合到80％-90％，将细胞消化传代，如此反复直至细胞传代P9代；按照程序降温方式，采用统一编码，将神经干细胞冻存在液氮灌中。进一步的，所述无血清培养基的配方如下：DMEM/F12(体积比l:l)、7g/L葡萄糖、4mmo/L谷氨酰胺、5mmol/LHepes缓冲液、5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、20nmol/L孕酮、100μg/ml腐胺，30nmol/L硒化钠、5μg/ml肝素、碳酸氢钠调pH值为7.2-7.4。进一步的，所述原代神经干细胞培养方法为连续培养10-14天，期间每24小时进行观察，确认细胞生长状态，每隔48-72小时进行换液；所述P1代神经干细胞培养方法为每间隔48-72小时进行换液，连续培养10-14天。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：步骤操作简单，获取、培养、冻存的人神经干细胞纯度高、增殖能力强、复苏效率高、解决了神经干细胞制备生产、保存等问题。附图说明图1为本专利技术人神经干细胞细胞库的构建方法的整体流程示意图；图2为本专利技术人神经干细胞细胞库的构建方法的悬浮培养的神经干细胞在显微镜的形态示意图。图3为本专利技术人神经干细胞细胞库的构建方法的流式鉴定检测结果示意图。具体实施方式为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。将取材得到的人源性脑皮层和缓冲液用无菌一次性3ml滴管转移进入一个或者多个15/50ml离心管，静置5分钟，使脑组织块充分沉淀到管底，吸弃上清液，然后用无菌注射器和0.22mm滤膜进行无菌过滤，直接滤入离心管中，每个15ml离心管中需5ml消化液，之后进行轻微晃动，将离心管置于37℃，5％二氧化碳培养箱消化，每5分钟手动震荡一次，消化30分钟后，离心300g，5分钟，20℃。最后用无菌一次性3ml滴管吸弃上清至50μl，用1ml枪头吸取950μl缓冲溶液加入离心管，轻柔吹吸10-15次，以形成单细胞悬液。接种：配制的神经干细胞培养液20ml并加入低吸附T75培养瓶中，计数得到的悬液细胞密度及配制成200个/ul的最终细胞接种密度，混匀细胞悬液，用移液枪在液面下再次吹打，取出计算体积的单细胞悬液，迅速加入低吸附T75培养瓶中，并轻轻从不同方向晃动容器，使细胞在培养液中均匀分布，将接种后的T75培养瓶迅速放入二氧化碳培养箱中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。所述无血清培养基的配方如下：配方如下：DMEM/F12(体积比l:l)、7g/L葡萄糖、4mmo/L谷氨酰胺、5mmol/LHepes缓冲液、5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、20nmol/L孕酮、100μg/ml腐胺，30nmol/L硒化钠、5μg/ml肝素、碳酸氢钠调pH值为7.2-7.4。实施例1：原代细胞培养:原代细胞接种培养后，按照每隔2天，进行细胞培养液置换，基本操作如下：从二氧化碳培养箱中取出T75培养瓶，放入生物安全柜中，用2ml的无菌移液管，取出已配置好的神经干细胞培养液营养补充液2ml，迅速加入低吸附T75培养瓶中，并轻轻从不同方向晃动，使细胞均匀分布。将加好补液的低吸附T75培养瓶迅速放回二氧化碳培养箱中，培养温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5％。细胞收获神经干细胞培养至7-10天，观察细胞生长状态，用无菌吸管将低吸附T75培养瓶中的神经球和培养液吸入50ml离心管中，100g，4℃，离心10min，使神经球充分沉淀到管底，尽量吸去上清液，将吸取的上清液放入无菌容器中，得到原代神经干细胞。P1-P5代神经干细胞的制备：原代细胞培养、计数、消化、洗涤、传代及培养，鉴定、分装及冻存。原代神经干细胞传代与培养：将已配好的10ml无菌神经消化液用无菌注射器注入装有原代神经干细胞球的离心管中；封口，静置3分钟，加入准备好的除菌神经组织消化液，放入37℃的二氧化碳培养箱中作用30分钟(每10分钟手动震荡一次5秒)，低温离心机4℃，300g，离心10分钟；用无菌一次性吸管吸弃上清，用移液枪和移液管加入5mlDMEM/F12冲洗，上下吹打2-3次，使组织分离，低温离心机4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人神经干细胞细胞库的构建方法，其步骤具体如下：/n步骤一：采集人神经干细胞；/n步骤二：原代细胞培养、鉴定原代神经干细胞、原代细胞的传代及部分冻存；/n步骤三：神经干细胞纯化、传达及扩大培养；/n步骤四：鉴定神经干细胞、程序降温及编码入库。/n

【技术特征摘要】
1.一种人神经干细胞细胞库的构建方法，其步骤具体如下：
步骤一：采集人神经干细胞；
步骤二：原代细胞培养、鉴定原代神经干细胞、原代细胞的传代及部分冻存；
步骤三：神经干细胞纯化、传达及扩大培养；
步骤四：鉴定神经干细胞、程序降温及编码入库。


2.如权利要求1所述的人神经干细胞细胞库的构建方法，其特征在于：步骤一的原代神经干细胞的来源为哺乳类神经干细胞，所述原代神经干细胞为手术分离废弃脑组织，包括额叶皮层、中脑及海马区脑组织，眼科反复切割，在DEME/F12(体积比：1:1)漂洗，过200目滤网，离心获得原代神经干细胞悬液。


3.如权利要求1所述的人神经干细胞细胞库的构建方法，其特征在于：步骤二用无血清培养基和培养工艺消化计数后，进行重悬，并调整密度1×105个/ml，在超低吸附培养液中，置于37℃，5％CO2中环境中进行培养。其中，无血清培养基是由DMEM/F12，B27，N2，以及神经营养因子BFGF，EGF，LIF组成，无任何动物血清成分。


4.如权利要求1所述的人神经干细胞细胞库的构建方法，其特征在于：步骤三将扩增满的原代神经干细胞进行消化、传代、直至传代到第5代，并鉴定细胞纯度达95％以上后，作为种子细胞，将种子细胞按照程序降温进行冻存，便于保存，当扩增原代细胞直径超过300μm时，然后进行消化传达至P1代神经干细胞；P1代神经干细胞消化后接种至超低吸附培养瓶中，放入37℃，5％CO2的环境中进行培养至传代，重复消化，接种、...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫红，安文强，秦娇，汤永永，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11