一种CHO细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用技术方案

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CHO细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用。利用本发明专利技术APRT基因缺陷型CHO细胞系构建重组蛋白表达系统，无论是否存在G418筛选压力，第60代APRT基因缺陷型CHO细胞构建的重组蛋白表达系统中目的蛋白eGFP的表达维持率远高于正常重组CHO细胞中eGFP的表达维持率；在无G418筛选压力时，利用本发明专利技术CHO细胞构建的重组蛋白表达系统第30代细胞中重组玻璃粘连蛋白的表达量显著高于正常CHO细胞中相应目的蛋白的表达量。本发明专利技术重组蛋白表达系统能够显著提高CHO细胞中目的基因的表达量和长期表达稳定性，克服了目前CHO细胞表达系统存在的表达不稳定的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种CHO细胞系、构建方法、重组蛋白表达系统、应用。
技术介绍
中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞表达系统是目前药用重组蛋白(抗体)等生物医药研发和生产的重要平台，是目前应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞具有易进行遗传改造和扩增、易被转染、正确的蛋白折叠和糖基化修饰、产物可分泌表达并易于纯化、悬浮培养、细胞密度较高、可大规模生产等方面的优势。在重组药物蛋白工业化生产中，从CHO重组表达种子细胞库扩大培养至大型生物反应器规模，细胞至少需要稳定传代培养30代。然而在长期传代培养过程中仍存在重组蛋白表达不稳定性、甚至表达量显著下降的问题，即不同重组CHO细胞克隆之间转基因表达水平、稳定性存在差异。由于细胞克隆间的这种表达不稳定性和表型高度异质性，使得筛选获得稳定高效表达的CHO细胞系费时费力且不可预测，造成研发和生产周期长、细胞大规模培养成本高，已成为制约重组药物蛋白工业化生产的“卡脖子”技术和“瓶颈”问题。因此，利本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CHO细胞系，其特征在于，经基因敲除改造而不表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT的CHO细胞系。/n

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞系，其特征在于，经基因敲除改造而不表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT的CHO细胞系。


2.如权利要求1所述的CHO细胞系，其特征在于，经基因编辑技术敲除APRT基因的CHO细胞系，其中APRT基因序列如SEQIDNO.1所示。


3.如权利要求1或2所述的CHO细胞系，其特征在于，所述CHO细胞系选自CHO-K1、CHO-S或CHO-106。


4.一种如权利要求2所述的CHO细胞系的构建方法，其特征在于，包括利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除APRT基因。


5.如权利要求4所述的CHO细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)确定打靶位点：根据NCBI的GeneBank中仓鼠腺嘌呤磷酸核糖转移酶APRT基因序列No.X03603.1，设计两个打靶位点sgRNA序列；
2)sgRNA载体的构建：将步骤1)设计的sgRNA序列添加粘性末端并合成2对4条引物，将配对的引物退火获得对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接到两个带有不同荧光报告基因CRISPR/Cas9系统表达载体中，获得两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体；
3)将两个CRISPR/Cas9-sgRNA载体共同转染至CHO细胞中；流式分选挑选包含两种荧光报告基因信号的单克隆细胞进行培养，经过敲除细胞APRT基因的PCR扩增和测序验证，即得。


6.如权利要求5所述的CHO细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1)中设计两个打靶位点sgRNA序列的操作步骤包括：
a：根据选定的APRT基因组序列设计扩增引物，进行APRT基因片段PCR扩增，扩增引物序列为：
A...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾岩龙，王天云，路江涛，杨亮，倪天军，王小引，郭潇，林艳，王冲，
申请(专利权)人：新乡医学院，河南医学高等专科学校，河南普诺易生物制品研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41