一种含有CLCN2纯合突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系制造技术

本发明专利技术公开了一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。收集CLCN2基因突变患者的尿液，分离和培养尿液细胞，尿液细胞重编程为诱导多能干细胞，获得含有CLCN2纯合突变(C.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。该诱导多能干细胞的STR与CLCN2患者的相同，表达多潜能分子标签，体内具有形成畸胎瘤能力，可为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新的生物材料和细胞模型工具。

【技术实现步骤摘要】
一种含有CLCN2纯合突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系极其构建方法。
技术介绍
CLCN2基因是编码氯离子通道2(ChlorideChannel2,ClC-2)蛋白的基因。ClC-2在人体中分布广泛，尤其在大脑中表达较高，其在调节水电解质平衡中发挥重要作用[1]。ClC-2在多个器官和组织中发挥功能[2]，其中CLCN2相关白质脑病(CLCN2-relatedleukoencephalopathy,CC2L)是由CLCN2基因突变进而导致ClC-2功能障碍而引起的常染色体隐性遗传病。CC2L患者常表现有视网膜脉络膜病变或视神经萎缩、男性不育、小脑性共济失调、认知障碍、学习障碍等，颅脑MRI通常提示髓鞘空泡变性[3-5]。在中枢神经系统中，ClC-2主要分布在少突胶质细胞周围的缝隙连接处、海马的锥体神经元中以及血管周围基底的星形胶质细胞末端[1]。有学者认为，ClC-2在神经活动后会通过星形胶质细胞合胞体重吸收Cl-以维持神经元的兴奋性[6]。关于CC2L，目前仅有少量的病例报道，且由于尚无合适的疾病模型，其致病机制尚不明确，目前也无有效的治疗手段。因此，创建用于研究CLCN2基因相关疾病的体外细胞模型是很有必要的。随着体细胞重编程技术的发展，获取患者特异的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)成为现实[7]。研究表明，iPSCs具有向机体几乎所有细胞分化的能力，不仅可构建多种体外细胞模型进行疾病机制的研究以及药物筛查[8]，还由于其具有患者特异性，可减少免疫排斥的优势，可用于替代移植治疗[9,10]。因此，构建含有CLCN2突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系，可以为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新的生物材料。参考文献：1、DepienneC,BugianiM,DupuitsCetal.BrainwhitematteroedemaduetoClC-2chloridechanneldeficiency:anobservationalanalyticalstudy[J].LancetNeurol,2013,12(7):659-668.2、BrennanSC,WilkinsonWJ,TsengHetal.Theextracellularcalcium-sensingreceptorregulateshumanfetallungdevelopmentviaCFTR[J].ScientificReports,2016,6(1).3、vanderKnaapMS,DepienneC,SedelFetal.CLCN2-RelatedLeukoencephalopathy[J].2015.4、BlanzJ,SchweizerM,AubersonMetal.LeukoencephalopathyuponDisruptionoftheChlorideChannelClC-2[J].JournalofNeuroscience,2007,27(24):6581-6589.5、EdwardsMM,MarínDeEvsikovaC,CollinGBetal.Photoreceptordegeneration,azoospermia,leukoencephalopathy,andabnormalRPEcellfunctioninmiceexpressinganearlystopmutationinCLCN2[J].Investigativeophthalmology&visualscience,2010,51(6):3264.6、Bellot-SaezA,KekesiO,MorleyJWetal.AstrocyticmodulationofneuronalexcitabilitythroughK(+)spatialbuffering[J].NeurosciBiobehavRev,2017,77:87-97.7、TakahashiK,TanabeK,OhnukiMetal.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors[J].Cell,2007,131(5):861-872.8、邢红艳，张艺哲，王美婷，赵琪，汪溪洁，等.人诱导多能干细胞分化的心肌细胞在疾病模型和药物筛选中的应用[J].中国医药工业杂志,2019,50(08):834-841.9、AoiT.10thanniversaryofiPScells:thechallengesthatlieahead[J].JBiochem,2016,160(3):121-129.10、Ortuno-CostelaM,CerradaV,Garcia-LopezMetal.TheChallengeofBringingiPSCstothePatient[J].IntJMolSci,2019,20(24).
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系及其构建方法，构建含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系，可以为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新型生物材料。本专利技术的含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系是通过以下方法构建的：收集CLCN2基因突变患者的尿液，分离和培养尿液细胞，尿液细胞重编程为诱导多能干细胞，获得含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系；所述的CLCN2基因突变是CLCN2基因的第2257位碱基由C突变为T(氨基酸第753位由Arg突变为Ter)，为纯合突变。所述的尿液细胞重编程为诱导多能干细胞是在尿液细胞中电转入包含有OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4基因的非整合质粒和包含有miR-302b,c,a,dandmiR-367的质粒，再经培养获得含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。所述的包含有OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4基因的非整合质粒是OriP/EBNA1非整合质粒pEP4EO2SET2K。所述的包含有miR-302b,c,a,dandmiR-367的质粒是pCEP4-miR-302-367质粒。优选，所述的分离和培养尿液细胞是尿液收集后进行离心，细胞沉淀用含有抗生素的PBS洗涤，重悬于原代培养基中，重悬的细胞接种到L-gelatin包被的六孔板中，细胞密度长到80-90％，进行消化传代，获得尿液细胞，所述的原代培养基为DMEM/Ham’sF-12nutrientmix(1:1)+1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞，其特征在于，/n收集CLCN2基因突变患者的尿液，分离和培养尿液细胞，尿液细胞重编程为诱导多能干细胞，获得含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系；所述的CLCN2基因突变患者是CLCN2基因的第2257位碱基由C突变为T，为纯合突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞，其特征在于，
收集CLCN2基因突变患者的尿液，分离和培养尿液细胞，尿液细胞重编程为诱导多能干细胞，获得含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系；所述的CLCN2基因突变患者是CLCN2基因的第2257位碱基由C突变为T，为纯合突变。


2.根据权利要求1所述的白质脑病患者特异诱导多能干细胞，其特征在于，所述的尿液细胞重编程为诱导多能干细胞是在尿液细胞中电转入包含有OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4基因的非整合质粒和包含有miR-302b,c,a,dandmiR-367的质粒，再经培养获得含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。


3.根据权利要求1所述的白质脑病患者特异诱导多能干细胞，其特征在于，所述的分离和培养尿液细胞是尿液收集后进行离心，细胞沉淀用含有抗生素的PBS洗涤，重悬于原代培养基中，重悬的细胞接种到L-gelatin包被的六孔板...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭福华，钟秀风，陈灼林，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44