本发明专利技术提供一种改善人肺腺癌厄洛替尼的耐药性的shRNA，包括3对针对Homo Rab25基因的shRNA，其三段靶序列Homo Rab25‑1：CTCTACCAATGTTGAGCTA，Homo Rab25‑2：CATGCTCGTGGGTAACAAA和Homo Rab25‑3：CTGCTGTCAAGGCTCAGAT。以进一步探讨Rab25的功能及其在非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂耐药形成中的作用。本发明专利技术属于肺癌治疗领域。
An improved human lung adenocarcinoma erlotinib resistance shRNA
The present invention provides an improved human lung adenocarcinoma erlotinib resistant shRNA, including 3 for Homo Rab25 gene shRNA, three Homo Rab25 1:CTCTACCAATGTTGAGCTA target sequence, Homo Rab25 and Homo 2:CATGCTCGTGGGTAACAAA Rab25 3:CTGCTGTCAAGGCTCAGAT. To further investigate the function of Rab25 and its role in the formation of tyrosine kinase inhibitor resistance in non-small cell lung cancer. The invention belongs to the field of lung cancer treatment.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种慢病毒介导的shRNA靶向干扰Rab25基因人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞PC9/ER稳定株的建立方法，属于肺癌治疗领域。
技术介绍
Rab蛋白家族是Ras超家族中最大的亚家族，为小GTP结合蛋白，Rab25是Rab家族的重要成员之一。有研究证实Rab25在乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中表达上调，并可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。也有研究显示Rab25的过表达与顺铂的耐药密切相关，提示其参与了肿瘤耐药的发生。为观察沉默Rab25基因对非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药细胞生物学行为的影响，进一步探讨Rab25的功能及其在非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitors,EGFR-TKIs)耐药形成中的作用，建立稳定抑制Rab25基因表达的人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞PC9/ER是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种改善人肺腺癌厄洛替尼的耐药性的shRNA，以进一步探讨Rab25的功能及其在非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂耐药形成中的作用。为解决上述问题，拟采用这样一种shRNA，包括3对针对HomoRab25基因的shRNA，其三段靶序列HomoRab25-1：CTCTACCAATGTTGAGCTA，HomoRab25-2：CATGCTCGTGGGTAACAAA和HomoRab25-3：CTGCTGTCAAGGCTCAGAT。其引物序列分别为RAB25-RNAi(1)、RAB25-RNAi(2)和RAB25-RNAi(3)，RAB25-RNAi(1)上游序列如序列表SEQNO.1所示，下游序列如序列表SEQNO.2所示，RAB25-RNAi(2)上游序列如序列表SEQNO.3所示，下游序列如序列表SEQNO.4所示，RAB25-RNAi(3)上游序列如序列表SEQNO.5所示，下游序列如序列表SEQNO.6所示。上述shRNA能够改善人肺腺癌厄洛替尼耐药性，可用于制备改善人肺腺癌厄洛替尼耐药性的药物。本专利技术根据shRNA设计原则，设计并合成上述3对针对HomoRab25基因的shRNA,体外将其退火后连接到载体GV248，经酶切和测序结果证实无误后，在病毒包装系统的参与下，采用脂质体转染的方法将其转染入293T细胞；提取上清，浓缩测定病毒含量后，感染人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株PC9/ER，通过RT-PCR检测转染后各组细胞HomoRab25基因mRNA表达情况。前述方法中，RT-PCR检测PC9ER及PC9细胞中Rab25基因mRNA的相对表达情况，筛选出Rab25基因的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA并构建GV248-shRNA-Rab25慢病毒载体，酶切和测序鉴定正确后，经病毒包装，感染PC9/ER细胞，经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株，通过实时定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)鉴定PC9/ER的表达，通过CCK-8检测对厄洛替尼的敏感性。Rab25基因shRNA靶序列的设计及合成：依据GenBank中人Rab25基因序列，根据shRNA设计原则，采用clotech网页提供的设计程序，设计3段靶序列HomoRab25-1：CTCTACCAATGTTGAGCTA，HomoRab25-2：CATGCTCGTGGGTAACAAA和HomoRab25-3：CTGCTGTCAAGGCTCAGAT；按引物结构：AgeI+Sense+Loop+Antisensecomplement+终止信号+EcoRI设计引物，以含无义shRNA序列的慢病毒作为对照，完整序列见基因序列表。Rab25基因shRNA重组质粒的构建：分别将3对正义与反义寡核苷酸单链稀释，等浓度混合，加入退火缓冲液混匀，使其终浓度为100ng/L，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温；取空质粒GV248用AgeI/EcoRI内切酶双酶切，1％琼脂糖凝胶回收大片段，电泳鉴定后，将退火后的双链shRNA模板与GV248线性化载体按1:1配比，在T4连接酶作用下16℃水浴连接过夜；次日各取5l连接产物转化感受态细胞DH5α，分别涂布于含ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜；从每个培养皿上各挑取在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10LLB溶液，混匀取1L作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游设计通用PCR引物(GV248-RNAiupprimer：5’-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3’；GV248-RNAiupdown：5’-GAGGCCAGATCTTGGGTG-3’)，进行菌落PCR鉴定实验，反应条件：94℃30s；94℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸6min。Rab25shRNA慢病毒包装及滴度测定：转染前一天，用胰酶消化生长状态良好的293T细胞，调整细胞密度为6×105个/mL接种于15cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2孵箱内培养，转染前细胞融合度达80％～90％，更换培养基为无血清的opti-MEM；将重组的GV248载体20g，pHelper1.0载体15g，pHelper2.0载体10g，与相应体积的opti-MEM共2.5mL加入5ml离心管中混匀，室温孵育5min；另取一Ep管加入100L的lipofectamine2000，余补加opti-MEM共2.5mL，混匀后室温孵育5min；把稀释后的DNA与lipofectamine2000混匀，室温孵育20min；最后转移至293T的培养基中，混匀，于37℃，5％CO2孵箱中培养；转染后6h，更换成含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养；转染后24h荧光显微镜下观察预估转染率；转染后48h收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，于4℃，1200r/min离心10min，离心半径16cm，除去细胞碎片，再用0.45m的滤膜过滤后，上清分装。Rab25shRNA慢病毒感染人非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株PC9/ER：取对数生长期的PC9/ER细胞，以2×105细胞/孔接种于6孔板内，培养24h后，阴性对照组及RNAi组去除原培养基，培养液为感染增强液，总体积1mL，含polybrene终浓度7.5g/mL，其中相应病毒颗粒与细胞数比例为100∶1，即感染复数为100；空白对照组只更换为1ML新鲜培养基；12小时后3组均更换含10％胎牛血清的RPMI-1640新鲜培养基；转染后3天荧光显微镜下观察转染情况，转染后第4天使用TRIzol提总RNA，荧光定量PCR测定Rab25mRNA表达水平，剩余细胞使用含2g/mL且含10％胎牛血清的RPMI-1640新鲜培养性筛选培养，稳定传代5代以上。RT-PCR检测各组PC9/ER细胞中Rab25mRNA的表达：根据GenBank中的Rab25基因序列，用Premier5.0软件设计PCR引物，序列如下：上游：5’-GGACCAATGCCATCACTCT-3’，下游：5’-ACCAAAGGGCAAGGAAAG-3’，扩增片段长171bp。内参本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种shRNA，其特征在于：包括3对针对Homo Rab25基因的shRNA，其三段靶序列Homo Rab25‑1：CTCTACCAATGTTGAGCTA，Homo Rab25‑2：CATGCTCGTGGGTAACAAA和Homo Rab25‑3：CTGCTGTCAAGGCTCAGAT。
【技术特征摘要】
1.一种shRNA，其特征在于：包括3对针对HomoRab25基因的shRNA，其三段靶序列HomoRab25-1：CTCTACCAATGTTGAGCTA，HomoRab25-2：CATGCTCGTGGGTAACAAA和HomoRab25-3：CTGCTGTCAAGGCTCAGAT。2.根据权利要求1所述一种shRNA，其特征在于：其引物序列分别为RAB25-RNAi(1)、RAB25-RNAi(2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：马虎，周建国，张钰，柏玉举，吕水萍，刘大海，岳国军，石磊，张廷友，沈刚，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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