本发明专利技术公开了一种利用枯草芽孢杆菌生产饲用抗菌肽的工艺及其应用，公开了保藏号为CCTCC M 2016402的枯草芽孢杆菌BW115，本发明专利技术的工艺采用枯草芽孢杆菌BW115表达家蚕抗菌肽，通过研究补料分批高密度发酵工艺，经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵生产工艺条件，得到的发酵液的生物效价达到10，000U/ml以上，经喷雾干燥得到的抗菌肽产品，含水量小于5%，生物效价达到80，000U/g以上。本发明专利技术的抗菌肽应用于饲料添加，能显著提高养殖动物生产性能；与现有同类产品相比，本发明专利技术具有产品生物效价高、原料成本低、发酵周期短、工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物发酵
，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌生产饲用抗菌肽的工艺及其应用。
技术介绍
乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆等是常用的发酵工业用碳源。牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉等是常用的发酵工业用氮源。碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子是组成基础发酵生产培养基的成分。通过在基础发酵生产培养基中补充碳源、氮源，进行补料分批高密度发酵工艺优化，可以显著提高生物发酵效价，降低发酵原料成本，缩短发酵生产周期，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。市场上的同类抗菌肽产品，主要以生物效价作为其产品的质量评价指标，其发酵液的生物效价一般在6，000U/ml以下；喷雾干燥成品的含水量在5%以下，生物效价一般在40，000U/g。目前枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的工艺仍然存在成本过高，过程复杂，生产周期长，产物效价低等问题。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术中的上述问题，采用枯草芽孢杆菌BW115及优化的补料分批高密度发酵生产工艺生产的抗菌肽，其发酵液的效价达10，000U/ml以上，喷雾干燥成品的含水量5%以下、生物效价达80，000U/g以上；具有生物效价高，原料成本低、发酵周期短的优势。该抗菌肽作为饲料添加剂，添加在全价配合饲料中，能显著提高养殖动物生产性能。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的枯草芽孢杆菌BW115(BacillussubtilisBW115)，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2016402。本专利技术第一个方面提供一种生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：步骤1获得生产菌株将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的生产菌株即枯草芽孢杆菌BW115，将其保存备用；步骤2液体种子发酵培养将步骤1中得到的生产菌株活化后接种基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；步骤3发酵罐中发酵培养将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，经流加补充碳源和氮源中的任意一种或者其组合，进行发酵培养获得发酵液；步骤4获得抗菌肽产品将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经60-600℃，进行喷雾干燥处理后，得到抗菌肽产品。其中，枯草芽孢杆菌BW115，是利用基因重组技术，将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到质粒pPIC9K中得到重组质粒，再将重组质粒转化枯草芽孢杆菌，经筛选得到稳定表达的菌株，表达家蚕抗菌肽。家蚕抗菌肽属于杀菌力最强的天蚕素-B类抗菌肽，由37个氨基酸残基组成，含25%的α-螺旋氨基酸，伸展结构的氨基酸占32%，含43%的无规则卷曲氨基酸。优选地，上述步骤1中质粒是pPIC9K质粒。优选地，上述步骤3中补充的碳源选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆中的一种或几种。优选地，上述步骤3中补充的氮源选自牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉中的一种或几种。优选地，上述步骤3中发酵培养条件为：发酵温度是20-40℃；搅拌转速是100-500r/min；通气比是1:（0.5-2.0）；罐压是0.01-0.10Mpa。优选地，上述步骤3中所获得的发酵液，其生物效价达到10，000U/ml以上。优选地，以质量百分比计，上述步骤3中的补充碳源的用量为0.1-10%。优选地，以质量百分比计，上述步骤3中的补充氮源的用量为0.1-10%。优选地，上述步骤4中所获得的抗菌肽产品含水量小于5%，并且其生物效价达到80，000U/g以上。本专利技术第二个方面提供上述工艺生产得到的抗菌肽。本专利技术第三个方面提供上述工艺所制备的抗菌肽在饲料领域中的应用。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：1）本专利技术利用枯草芽孢杆菌BW115，进行补料分批高密度优化发酵生产工艺，发酵培养产生的发酵液的生物效价达到10，000U/ml以上，远高于已知技术中的发酵液生物效价。2）与传统方法生产的抗菌肽相比，本专利技术生产的抗菌肽，具有更广谱的抗菌活性、pH适用范围更广、耐热性能更好，喷雾干燥成品的含水量5%以下，并且生物效价达到80，000U/g以上。3）采用本专利技术中的工艺生产的抗菌肽，原料成本低，发酵周期短，作为饲料添加剂，可与抗菌素联用或替代抗菌素使用，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限制本专利技术范围。实施例1本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源、氮源和培养条件为：（1）碳源：葡萄糖5%；（2）氮源：酵母浸粉4%；（3）发酵工艺条件：发酵培养温度30℃；搅拌转速300r/min；通气比1:1.5；罐压0.03-0.08Mpa。本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至30℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养8小时，流加补充碳源、氮源，继续进行发酵培养，获得发酵液；步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度180℃，出风温度90℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。本实施例获得的抗菌肽，是在5吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为10，450U/ml，喷雾干燥产品效价为86，230U/g，含水量为3.2%。实施例2本实施例中生产饲用抗菌肽工艺中发酵罐中补充的碳源和培养条件为：（1）碳源：葡萄糖3%、蔗糖3%；（2）发酵工艺条件：发酵培养温度32℃；搅拌转速200r/min；通气比1:1.2；罐压0.03-0.05Mpa。本实施例中生产饲用抗菌肽的工艺，包括如下步骤：步骤1：将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到pPIC9K质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的菌株得到生产菌株，即枯草芽孢杆菌BW115，将其放置于液氮罐中，保藏备用；步骤2：将基础发酵培养基在121℃条件下，灭菌30分钟后冷却至32℃，然后将步骤1中得到的生产菌株活化后接种至基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；步骤3：将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，发酵培养4小时，流加补充碳源，继续进行发酵培养，获得发酵液；步骤4：将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经进风温度160℃，出风温度80℃条件下，进行喷雾干燥处理，得到抗菌肽产品。本实施例获得的抗菌肽，是在10吨发酵罐规模下发酵生产，经过检测，其发酵液效价为11，330U/ml，喷雾干燥产品效价为90，120U\本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌BW115，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BW115保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016402。
【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌BW115，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BW115保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2016402。2.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BW115生产饲用抗菌肽的工艺，其特征在于，包括以下步骤：步骤1获得生产菌株将家蚕抗菌肽CAD基因克隆到质粒中形成重组质粒，然后将得到的重组质粒转化枯草芽孢杆菌，再筛选出稳定表达抗菌肽CAD的生产菌株即权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BW115，将其保存备用；步骤2液体种子发酵培养将步骤1中得到的生产菌株活化后接种基础发酵培养基，进行液体种子发酵培养获得种子发酵液；步骤3发酵罐中发酵培养将步骤2中得到的种子发酵液接种于发酵罐中，经流加补充碳源和氮源中的任意一种或者其组合，进行发酵培养获得发酵液；步骤4获得抗菌肽产品将步骤3中所获得的发酵液，添加辅料，经60-600℃，进行喷雾干燥处理后，得到抗菌肽产品。3.根据权利要求2所述的生产饲用抗菌肽的工艺，其特征在于，所述步骤1中质粒是pPIC9K质粒。4.根据权利要求2所述的生产饲用抗菌肽的工艺，其特征在于，所述步骤3中补充的...
【专利技术属性】
技术研发人员：高潮，陆克文，郑云峰，柯永中，
申请(专利权)人：上海邦成生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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