本发明专利技术公开了生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用，构建方法为：(1)在谷氨酸棒杆菌中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta‑ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除基因pck，得到菌株CB6；(2)将质粒pXA和质粒pEP2tuf‑rhtA转入到CB6菌株中。本发明专利技术构建的菌株在以10g/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5‑氨基乙酰丙酸，这为后续发酵罐连续补料提高5‑氨基乙酰丙酸的产量和产率奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用。
技术介绍
5-氨基乙酰丙酸，分子量为131.13，熔点为118℃。是一种非蛋白氨基酸。5-氨基乙酰丙酸具有副作用小、渗透性好的的特点，已经被广泛的应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌的诊断以及光动力治疗(PDT)中。同时，5-氨基乙酰丙酸在农业上也有很重要的应用如作为植物生长调节剂、除草剂和绿色农药等。在自然界中，5-氨基乙酰丙酸生物合成主要有以下两条途径：即C4途径和C5途径。C4途径是由琥珀酰CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合酶作用下缩合生成5-氨基乙酰丙酸，这条途径存在于动物、真菌和非硫光合细菌中。而C5途径则是在tRNA参与下，经过三步反应催化生成5-氨基乙酰丙酸，该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌中，包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。目前，仅有少量关于谷氨酸棒杆菌利用C5途径生产5-氨基乙酰丙酸的报道，但是该途径比较复杂，5-氨基乙酰丙酸的产量和得率都很低。据检索，现在尚未有关于谷氨酸棒杆菌利用C4途径生产5-氨基乙酰丙酸的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。本专利技术的第二个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。本专利技术的第三个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：(1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck，得到菌株CB6；(2)将构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋白的质粒pEP2tuf-rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。上述方法构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。上述生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2发酵生产5-氨基乙酰丙酸的用途。有益效果本专利技术构建了一株利用C4途径生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株，该菌株在以10g/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5-氨基乙酰丙酸，这为后续发酵罐连续补料提高5-氨基乙酰丙酸的产量和产率奠定了基础。附图说明图1为基因操作靶点。图2A为质粒pXA的酶切验证图谱，图2B为质粒pEP2tuf-rhtA酶切验证图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但对本专利技术不作任何限制。本专利技术所用到的：原始菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032购于ATCC(American Type Culture Collection，http://www.atcc.org/)；E.coli MG1655购于CGSC(Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale.edu/)。原始质粒pK18mobsacB、pEC-XK99E、pXMJ19和pEP2购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。5-氨基乙酰丙酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。实施例1：敲除质粒pD-sacB的构建首先以HindIII切割后的pK18mobsacB线性片段作为模板，用如下引物sacB-1(SEQ ID NO.1)/sacB-2(SEQ ID NO.2)扩增sacB基因。将sacB基因片段经过MunI/EcoRV双酶切后与经过EcoRI/SmalI双酶切后的质粒pEC-XK99E进行连接，得到质粒pEC-XK99E-sacB。用如下的引物trcsacB-1(SEQ ID NO.3)/trcsacB-2(SEQ ID NO.4)，以pEC-XK99E-sacB质粒作为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段。用如下的引物pD-1(SEQ ID NO.5)/pD-2(SEQ ID NO.6)，以pK18mobsacB质粒作为模板扩增含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段，最后将经过AatII酶切的片段trcsacB和经过相同酶切的pD片段进行连接，得到质粒pD-sacB。实施例2：乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除和乙酸生成途径基因pta-ackA、pqo和cat的敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA的敲除：以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032基因组为模板，以ldh-1(SEQ ID NO.7)/ldh-2(SEQ ID NO.8)为引物扩增基因ldhA的上游片段，ldh-3(SEQ ID NO.9)/ldh-4(SEQ ID NO.10)为引物扩增基因ldhA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ldh-1/ldh-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用EcoRI/HindIII双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到质粒pD-ldhA。将pD-ldhA质粒转入到谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30℃，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25μg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ldh-1/ldh-4进行PCR验证，得到ldhA基因敲除菌株CB1。pta-ackA操纵子的敲除以C.glutamicum ATCC13032基因组为模板，以ackA-1(SEQ ID NO.11)/ackA-2(SEQ ID NO.12)为引物扩增操纵子pta-ackA的上游片段，ackA-3(SEQ ID NO.13)/ackA-4(SEQ ID NO.14)为引物扩增操纵子pta-ackA的下游片段。将两个片段切胶回收后，以等摩尔比例的片段为模板，以ackA-1/ackA-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用SalI/XbaI双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到pta-ackA操纵子敲除质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta‑ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck，得到菌株CB6；(2)将构建好的过表达5‑氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋白的质粒pEP2tuf‑rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5‑氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
【技术特征摘要】
1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta-ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除磷酸烯醇...
【专利技术属性】
技术研发人员：王智文，冯丽丽，陈涛，赵学明，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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