对于谷氨酸显示高活性的新型氨基转移酶、编码该酶的基因和它们的利用法制造技术

本发明专利技术提供一种用于从酮化合物廉价且高效地制造作为医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。对作为氨基供体的谷氨酸显示相比于对作为氨基供体的L-丙氨酸更高的活性，且以93%以上的高的光学纯度生成(S)1-苄基-3-吡咯烷酮的新型具有氨基转移酶活性的多肽、编码该多肽的基因、高表达该基因的转化体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够通过氨基转移反应将酮化合物高效地转换为光学活性氨基化合物的酶和使用该酶的光学活性氨基化合物的制造方法。所得到的光学活性氨基化合物能够作为医药品或农药等的中间体利用。
技术介绍
关于使用了氨基转移酶的光学活性胺的制造方法，到目前为止对于α -氨基酸的制造方法有很多报道，但关于α-氨基酸以外的光学活性胺化合物的制造方法的报告例则很少。近年来，发现了生成α-氨基酸以外的光学活性胺的氨基转移酶，期待利用作为一般的光学活性胺的有效的制造方法。但是，到目前为止已知的生成α -氨基酸以外的光学活性胺的氨基转移酶存在很多问题(非专利文献I)。例如，虽然使用α-氨基酸作为氨基供体，用酶法除去副生成的α-酮酸有用，但发挥作为氨基供体作用的α-氨基酸实质上昂贵且限定于溶解度低的丙氨酸。另外，在α -氨基酸以外的光学活性氨基化合物之中，尚未发现特别是以93%e.e.以上的高光学纯度生成作为医药品中间体有用的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的氨基转移酶(专利文献1、2，非专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2007-185133号公报专利文献2:W02006/126498号公报非专利文献非专利文献1:Trends in Biotechnology28, 324-332 (2010)非专利文献2:Adv.Synth.Catal.350，807-812 (2008)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题在于提供用于从酮化合物高效地制造作为医药品或农药等的中间体有用的光学活性氨基化合物的方法。解决问题的方法本专利技术的专利技术人等进行了以各种土壤分离菌为对象的筛选，结果发现了如下的微生物:该微生物具有氨基转移催化活性，以93%e.e.以上的高的光学纯度生成(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷，且作为氨基供体对于廉价且溶解度高的谷氨酸显示高活性。另外，成功地从该微生物中分离纯化出具有该活性的多肽。另外，以基因重组的方法获取编码该多肽的基因，明确了其碱基序列。此外，通过对使用该基因产生该酶的转化体进行育种，确立了能够制作更高活性的该转化体、能够在工业上制造光学活性的氨基化合物的方法。即，本专利技术为具有下述理化学性质⑴至(6)的多肽:(I)作用:催化如下的氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S) _1_苄基_3_氨基吡咯烷。(2)底物特异性:(a)氨基供体:对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性。(b)氨基受体:相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。(3)最适 pH:7.0 ~8.0 ;(4)最适温度:30 ~50°C ;(5)热稳定性:在ρΗ8.0、30~50°C处理30分钟时，保持处理前全部活性的70%以上的残留活性。(6)分子量:在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约为48kDa。另外，本专利技术为如下的多肽，该多肽包括与序列表的序列编号I表示的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列，具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基_3_氨基吡咯烷的活性。`或者本专利技术为如下的多肽，该多肽包括与序列表的序列编号I显示的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列，作为氨基供体对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。或者为如下的多肽，该多肽具有在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列，且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S) _1_苄基_3_氨基吡咯烷的活性。或者为如下的多肽，该多肽具有序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列，且作为氨基供体对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高活性。另外，本专利技术还为编码上述多肽的DNA、含有该DNA的载体、以及由该载体转化得到的转化体。另外，本专利技术为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括:在氨基供体的存在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与酮化合物作用。另外为一种光学活性氨基化合物的制造方法，其包括:在氨基受体的存在下，使上述多肽或上述转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。本说明书包含作为本申请的优选权基础的日本特许出愿2010-216546号所记载的全部内容。专利技术的效果通过分离对于廉价且溶解度高的谷氨酸显示高活性，以高的光学纯度生成光学活性氨基化合物的多肽，以及获得该多肽生产能力高的转化体，能够廉价且高效地制造目标光学活性氨基化合物。【具体实施方式】以下，详细地说明本专利技术。此外，本说明书中记述的DNA的分离、载体的制备、转化等基因操作只要没有特别说明，就能够通过“Molecular Cloning2nd Edition (Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)、 Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing Associates and Wiley-1nterscience) ” 等教科书中记载的方法进行。另外，酶活性的单位只要没有特别说明，就将I分钟得到Iymol的产物的酶量设为IU。1.本专利技术多肽的理化学的各项性质本专利技术多肽为具有以下理化学性质的多肽(I)作用:催化如下氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基_3_氨基吡咯烷。(2)底物特异性:(a)氨基供体:对于(S)-1-苯乙胺显示活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性。(b)氨基受体:相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。(3)最适 pH:7.0 ~8.0 ;(4)最适温度:30 ~50°C ；(5)热稳定性:在ρΗ8.0、30~50°C处理30分钟时，保持处理前全部活性的70%以上的残留活性。(6)分子量:在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约为48kDa。(底物特异性的测定方法-1:对于(S)-1-苯乙胺的活性)本专利技术多肽对于(S)-1-苯乙胺显示活性。其中，显示活性的意思是指:用以下的方法测定氨基转移活性时，I分钟生成的苯乙酮的量相对于粗纯化多肽液Iml为0.01 μ mol以上，优选为0.1ymol以上，更优选为Iymol以上。上述氨基转移酶活性能够通过以下的方法测定(称为“活性测定法A” )。在酶液0.2mL中添加具有下述组成的底物溶液0.8mL，在30°C使其反应60分钟后，添加6当量盐酸(規定塩酸)50 μ L使反应停止。通过下述条件利用高效液相色谱分析该反应液，对生成的苯乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其具有下述的理化学性质(1)，(1)作用：催化如下氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1?苄基?3?吡咯烷酮作用，生成光学纯度93%e.e.以上的(S)?1?苄基?3?氨基吡咯烷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.28 JP 2010-2165461.一种多肽，其具有下述的理化学性质(1)， (1)作用:催化如下氨基转移反应，该反应为在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用，生成光学纯度93%e.e.以上的(S) _1_苄基_3_氨基吡咯烷。2.根据权利要求1所述的多肽，其还具有下述的理化学性质(2): (2)底物特异性: (a)氨基供体:显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性； (b)氨基受体:相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸显示更高的活性。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其还具有以下的理化学性质(3)至(6):(3)最适pH:7.0 ~8.0 ; (4)最适温度:30~50°C; (5)热稳定性:在30~50°C处理30分钟时，保持处理前的70%以上的残留活性； (6)分子量:在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，约48kDa。4.根据权利要求1~3中 任一项所述的多肽，其中: 所述多肽为从属于节杆菌属(ArthiObacter属)的微生物获得的多肽。5.根据权利要求1~3中任一项所述的多肽，其中: 所述多肽为从节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)获得的多肽。6.根据权利要求1~3中任一项所述的多肽，其中: 所述多肽为从节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.) KNK04-25 (NITE BP-954)获得的多肽。7.一种多肽，其为以下(a)至(g)中任一项所述的多肽: (a)包括序列表的序列编号I所示的氨基酸序列的多肽； (b)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基_3_氨基吡咯烷的活性的多肽； (C)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且作为氨基供体显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β-丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸具有更高的活性的多肽； (d)包括在序列表的序列编号I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加了I个或多个氨基酸的氨基酸序列、且最适pH为7.0~8.0，最适温度为30~50°C，在30~50°C处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽； (e)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且具有在氨基供体的存在下与1-苄基-3-吡咯烷酮作用生成光学纯度93%e.e.以上的(S)-1-苄基-3-氨基吡咯烷的活性的多肽； (f)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且作为氨基供体显示对(S)-1-苯乙胺的活性，相比于L-丙氨酸对L-谷氨酸显示更高的活性，且对于β -丙氨酸、4-氨基丁酸实质上不显示活性，作为氨基受体相比于丙酮酸对2-氧代戊二酸具有更高的活性的多肽； (g)包括与序列表的序列编号I中记载的氨基酸序列具有50%以上的序列同一性的氨基酸序列、且最适pH为7.0~8.0，最适温度为30~50°C，在30~50°C处理30分钟时保持处理前的70%以上的残留活性，分子量在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中约为48kDa的多肽。8.包括编码权利要求1~7中任一项所述的多肽的碱基序列的DNA。9.根据权利要求8所述的DNA，其是下述⑷至(C)中任一项所述的DNA: (A)包括序列表的序列编号2中记载的碱基序列的DNA； (B)在严谨的条件下，和包括与序列表的序列编号2中记载的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交的DNA ； (C)包括在序列表的序列编号2中记载的碱基序列中，缺失、取代、插入或添加了I个或多个碱基的碱基序列的DNA。10.包含权利要求8或9所述的DNA的载体。11.由权利要求10所述的载体转化宿主细胞得到的转化体。12.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括: 在氨基供体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与酮化合物作用。13.—种通式(2)所示的 光学活性氨基化合物的制造方法，包括: 在氨基供体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与通式(I)所示的酮化合物作用， 通式⑴: 14.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括: 在氨基受体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与氨基化合物的对映体混合物作用。15.一种光学活性氨基化合物的制造方法，包括: 在氨基受体的存在下，使权利要求1~7中任一项所述的多肽或权利要求11所述的转化体的培养物与通式(3)所示的氨基化合物的对映体混合物作用，由此得到通式(4)所示的光学活性氨基化合物， 通式⑶: 16.根据权利要求13所述的制造方法，其中: 所述式(I)所示的酮化合物为选自1-四氢萘酮、2-四氢萘酮、5-甲氧基-2-四氢萘酮、6-甲氧基-2-四氢萘酮、7-甲氧基-2-四氢萘酮、8-甲氧基-2-四氢萘酮、1-苄基-3-吡咯烷酮、l-Boc-3-吡咯烷酮、l-Cbz-3-吡咯烷酮、1-苄基-3-哌啶酮、l-Boc_3-哌啶酮、l-Cbz-3-哌啶酮、苯乙酮、3，4- 二甲氧基苯基丙酮中的I种以上的酮化合物。17.根据权利要求15所述的制造方法，其中: 所述式(3)所示的氨基化合物为选自1-氨基1，2，3，4-四氢化萘、2-氨基1，2，3，4-四氢化萘、甲氧基-2-氨基1，2, 3, 4-四氢化萘、6-甲氧基-2-氨基1，2, 3, 4-四氢化萘、甲氧基_2_氨基1，2，3, 4-四氢化萘、8-甲氧基-2-氨基1，2，3, 4-四氢化萘、1-节基_3_氨基批咯烧、l-Boc-3-氨基批咯烧、l-Cbz-3-氨基批咯烧、1-苄基-3-氨基哌唳、l-Boc-3-氨基哌啶、l-Cbz-3-氨基哌啶、1-苯乙胺、3，4- 二甲氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊藤纪幸，西聪子，川野茂，八十原良彦，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：
国别省市：