本发明专利技术提供一种显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性且将序列编号1的193位的谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的该改变型脂肪酶的突变体、及使用它们制造氨基甲酸酯化合物的方法。另外，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改变型脂肪酶及其制造方法、以及使用该酶的反应
本专利技术涉及一种新型的改变型脂肪酶及其制造方法以及使用该酶的各种反应。更详细而言，涉及一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶。进而，涉及一种使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。另外，本专利技术涉及一种使用已知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
技术介绍
目前，将脂肪酶用作催化剂得到氨基甲酸酯化合物的方法(氨基甲酸酯化)例如已知有在脂肪酶的存在下通过3’，5’ - 二氨基核苷(脂肪族胺化合物)和碳酸二乙酯化合物的反应来合成氨基甲酸酯的方法(非专利文献I)。但是，脂肪酶相对于底物的添加量多、反应时间长且产物的收率也低，使用脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的制造方法难以说是满足产业化的制造方法。从这些方面考虑，寻求一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。另一方面，进行了改变脂肪酶的氨基酸序列来提高活性、稳定性的研究(非专利文献2和3)。但是，尚未得知通过改变氨基酸序列提高了氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。另外，专利文献I记载了通过改变脂肪酶(CALB)的氨基酸序列来增加丙烯酸酯活性，但记载了将104位的色氨酸单独取代为苯丙氨酸会造成活性的降低。现有技术文献专利文献专利文献:W02009/080676A1非专利文献非专利文献1:J.Org.Chem，2004年69卷p.1748-1751非专利文献2:ChemBioChem2010 年 11 卷 p.789-795非专利文献3:J.Amer.Chem.Soc.，2005 年 127 卷 p.13466-13467
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于，提供一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶、以及使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。另外，本专利技术的目的在于，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。用于解决课题的方法本专利技术的【专利技术者】们的目的在于，通过选择CALB作为脂肪酶，制作CALB的突变体来提高氨基甲酸酯化活性从而降低制造氨基甲酸酯化合物所需的成本。而且，进行了潜心研究，结果成功制成具有高于野生型的氨基甲酸酯化活性的突变CALB。另外，本专利技术的【专利技术者】们还发现，公知的改变型CALB具有较高的氨基甲酸酯化活性。即本专利技术提供下面的专利技术。(I) 一种改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将序列编号I的193 位谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示高于序列编号I所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193X (在此，X表示谷氨酰胺以外的任意的氨基酸)的序列编号I的单独改变型脂肪酶或其突变体。(2)根据(I)所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193E或Q193D的序列编号I的单独改变型脂肪酶或其突变体。(3)根据(I)或(2)所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F的序列编号I的双重改变型脂肪酶或其突变体。(4)根据(I )或(2)所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D] + [L278K或L278R]的序列编号I的双重改变型脂肪酶或其突变体。(5)根据(3)所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将 278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]的序列编号I的三重改变型脂肪酶或其突变体。(6)根据(5)所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将 283位的丙氨酸取代为缬氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]+A283V的序列编号I的四重改变型脂肪酶或其突变体。(7) 一种DNA，其编码(I)~(6)中任一项记载的改变型脂肪酶或其突变体。(8) 一种转化微生物，其含有(7)所述的DNA。(9) 一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于，在培养基中培养(8) 所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变体在培养基中和/或微生物中积累。(10) 一种改变型脂肪酶或其突变体，其是将(I)~(6)中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过(9)所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。(11) (I)~(6)和(10)中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过(9) 所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。( 12 )根据(11)所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。(13) 一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在(I)~(6)和(10)中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过(9)所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。(14)根据(13)所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中，碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。(15)将序列编号I的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。(16)根据(15)所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。(17)—种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在将序列编号I的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、 插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。(18)根据(17)所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中，碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。(19) 一种改变型脂肪酶或其突变体，显示高于序列编号I所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性，其中，该改变型脂肪酶是将序列编号I的278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基得到的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.02 JP 2011-103091;2011.11.25 JP 2011-256931.一种改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶是将序列编号I的193位的谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示高于序列编号I所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性。2.根据权利要求1所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。3.根据权利要求1或2所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。4.根据权利要求1或2所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。5.根据权利要求3所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。6.根据权利要求5所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于:该改变型脂肪酶进一步将2`83位的丙氨酸取代为缬氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。7.一种DNA，其特征在于:其编码权利要求1~6中任一项所述的改变型...
【专利技术属性】
技术研发人员：生田淳也，吉田洋一，山本康仁，
申请(专利权)人：宇部兴产株式会社，
类型：
国别省市：
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