一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和应用，所述枯草芽孢杆菌分离、筛选自中国重庆的传统发酵食品豆豉中，所述的枯草芽孢杆菌DC27保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M 2015573，本发明专利技术进一步提供了该菌株的液体发酵方法，所得发酵液中的纤溶酶活力可达4506IU/mL。该菌株来源于食品且能分泌高活性的纤溶酶，安全无毒，可应用于预防或缓解血栓性疾病的功能性食品或药品的开发中，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，具体涉及一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌及发酵方法和 应用，本专利技术所述的枯草芽孢杆菌分离筛选至豆豉，具有高产豆豉纤溶酶的能力，可用于预 防或缓解血栓性疾病的功能性食品或药品的开发中。
技术介绍
心血管疾病（cardiovasculardisease，CVDs)，如急性心肌梗死、缺血性心脏病和 高血压是世界上人类死亡的主要原因之一。据2001年世界卫生组织报告，每年约有1700 万人死于CVDs，到2020年，因CVDs而导致的每年死亡人数将增至2500万。在不同类型的 CVDs中，血栓性疾病已成为威胁人类健康的最主要的病因之一。因此，如何有效地预防和治 疗血栓性疾病，已引起国内外医学界和科技界的高度重视。 治疗血栓性疾病的方法主要有外科手术、保守疗法和溶栓疗法三种，其中溶栓疗 法以纤溶酶作为溶栓剂，使血管再通，治疗费用较低，是目前治疗血栓性疾病最为有效和可 靠的手段。相比临床上使用的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)、尿激酶（UK)和链激酶（SK)等 溶栓药物，食品来源的纤溶酶，如纳豆激酶和豆豉纤溶酶不仅血栓溶解能力强，而且具有安 全无毒、不引起内出血、生产成本低、在胃肠里的稳定性好以及在体内的半衰期长等优点。 豆豉是我国传统的大豆发酵食品，有上千年的历史，制作方式比日本的纳豆复杂。据中国药 典记载：豆豉具有开胃增食，消积化滞，祛风散寒以及预防心血管疾病等功效，经研究发现， 豆豉中的纤溶酶活性比纳豆来源的纳豆激酶活性更高。近年来，科研工作者相继从中国的 豆豉、日本的纳豆、韩国的豆酱和印尼的天培等传统发酵食品中发现并获得产纤溶酶的菌 株。然而，目前国内的纤溶酶产品活性普遍偏低。因此，从传统的发酵食品中分离筛选高活 性的纤溶酶菌株，并对其发酵方法进行研究，可为预防或治疗血栓性疾病功能性食品或药 品的开发奠定良好的基础，具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种枯草芽抱杆菌DC27,该菌株具有尚广?妓纤溶酶的特 性，安全无毒，可用于预防或治疗血栓性疾病功能性食品或药品的开发，该菌株已于2015 年9月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)DC27,保藏编号：CCTCCNO:M2015573,地址：中国武汉武汉大学。 本专利技术还有一个目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌的液体发酵方法，方法简 单，易行，利用本专利技术提供的发酵方法，采用50L发酵罐所得发酵液中的纤溶酶活力可达 4506IU/mL。 本专利技术的最后一个目的在于提供了枯草芽孢杆菌DC27在制备纤溶酶中的应用， 所述的应用包括利用该菌株生产的纤溶酶制备各种目前市场上流通的含有纤溶酶的产品。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施： -种枯草芽孢杆菌DC27,其筛选过程如下： 1)利用初筛培养基分离和筛选传统发酵豆豉中的芽孢菌，根据平板上的透明圈和 菌落大小的直径的比值来确定酶活较高的菌株。 初筛培养基：酪蛋白0.4%，NaCl 0.5%，琼脂2%。 2)利用复筛培养基将初筛获得的菌株进行复筛，通过纤溶酶活性测定和在血琼脂 培养基上的溶血性试验选择纤溶活力高且安全的菌株。复筛培养基：葡萄糖1%，大豆蛋白胨1%，Na2HP04 0 . 2%，NaH2P04 0. 1%，CaCl2 0· 02%，MgS04 0· 05%，ρΗ7· 0,115Γ灭菌15min。 血琼脂培养基：蛋白胨1%，酵母膏0. 3%，NaCl5%，Na2HP04 0 . 5%，甘露醇1%， 新鲜的人血5%~10%，琼脂1.5%，结晶紫10ppm，pH8.0。 3)最后筛选到一株纤溶酶酶活力较高且安全的菌株DC27,通过形态学、生理生化 鉴定和16SrRNA的分子鉴定初步确定为枯草芽孢杆菌，再根据特异PCR进一步确定为枯草 芽孢杆菌。该菌株已于2015年9月23日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命 名：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)DC27,保藏编号：CCTCCNO:M2015573。 枯草芽孢杆菌DC27的形态特征：DC27在LB平板培养基上的菌落形态与芽孢杆菌 相似，为圆形，边缘整齐，表面有褶皱，呈乳白色，半透明，有粘性。挑取单菌落经革兰氏染色 镜检，光学显微镜镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色为阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近 中生。 DC27的生理生化特征：见表1。 表1. DC27的生理生化特征 注：" + "表示生理生化反应（或革兰氏染色）阳性；表示表示生理生化反应 (或革兰氏染色）阴性；"d"表示11% -89%菌株为阳性；"ND"表示未测定。 特异PCR: 采用枯草芽孢杆菌的特异引物（上游引物为5'-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3'，下游 引物为5 '-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3 '），以枯草芽孢杆菌为阳性对照，进行菌落PCR，PCR程 序为：94°C预变性10min，94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环，72°C延 伸lOmin。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 枯草芽孢杆菌DC27在摇瓶中的液体发酵方法包括： 将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌DC27种子液以2% (体积比）的接种量接种到 液体发酵培养基（已灭菌）中，转速170r/min，装液量40mL/250mL，在37°C培养72h，发酵 液上清酶活可达到3185IU/mL。 所述的液体发酵培养基：玉米淀粉3%、大豆蛋白胨2%、Na2HP04 0 . 2%、NaH2P04 0·l%、CaCl2 0.02%、MgS04 0 . 05%，ρΗ8·0,115Γ灭菌 20min。 枯草芽孢杆菌DC27在50L发酵罐中的液体发酵方法包括： 将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌DC27种子液以2% (体积比）的接种量接种到 液体发酵培养基（已灭菌）中，发酵罐进气口压力〇· 25MPa，出气口压力0· 05MPa，搅拌速率 200r/min，装液量30L/50L，在37°C培养36h，发酵液上清酶活可达到4506IU/mL。 所述的液体发酵培养基：玉米淀粉3%、大豆蛋白胨2%、Na2HP04 0 . 2%、NaH2P04 0·l%、CaCl2 0.02%、MgS04 0 . 05%，ρΗ8·0,115Γ灭菌 20min。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点： 1)本专利技术的枯草芽孢杆菌DC27来源于豆豉中，菌株的安全性高； 2)本专利技术的初筛培养基选用酪蛋白培养基，配方简单，结果展示明显，缩短筛选时 间； 3)本专利技术筛选的枯草芽孢杆菌DC27菌株的初始酶活与现有菌株相比酶活较高， 安全无毒，利于改造为更为优良的菌株； 4)本专利技术筛选的枯草芽孢杆菌DC27产酶量大，采用摇瓶发酵纤溶酶活力可达 3185IU/mL，采用50L发酵罐可达4506IU/mL，是目前已知的豆豉纤溶酶酶活最高的菌株，而 且培养中所用原料廉价，大型发酵周期短（36h)，利于企业的大规模生产，在预防或治疗血 栓性疾病的功能性食品或药品开发方面具有很好的应用前景。【附图说明】 图1为?妓中的广蛋白酶菌株在酷蛋白平板上的活力不意图。 图2为一种枯草芽孢杆菌DC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产纤溶酶枯草芽孢杆菌，其特征在于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DC27 CCTCC NO：M2015573。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡咏梅，王昭婷，毛娉，梁运祥，葛向阳，赵述淼，王绩，梅余霞，陈正军，彭楠，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42