一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将α-糖基转移酶编码基因和β-糖基转移酶编码基因整合于枯草芽孢杆菌基因组上表达，同时，对枯草芽孢杆菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途径的基因，进行模块化组装表达分析，通过控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc浓度，实现枯草芽孢杆菌产不同分子量范围的肝素前体。本发明专利技术为食品级微生物高效生产制备肝素前体奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术涉及一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程

技术介绍
肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)属于一类高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元组成的不分支的带负电荷的多糖，由于其独特的生理功能，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物。肝素作为一种抗凝血和抗血栓药物，在深部静脉血栓形成、肾透析和留置导管分流术、及术后血栓控制等医疗措施中使用。同时还具有抗血脂，抗炎、抗肿瘤、抑制细菌粘附等作用，自1918年被发现后被广泛应用于临床作为抗凝血药物。其结构复杂、生物活性多样等特点，研发以肝素和硫酸乙酰肝素为骨架的新药已成为近年来多糖药物研究的热点。肝素前体(Heparosan)，又称N-Acetylheparosan，结构式为[-GlcUA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n(其中GlcUA是葡萄糖醛酸，GlcNAc是葡萄糖乙酰胺，是合成肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体，也是它们合成过程中最重要的模板)，其未被硫酸化且未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛，Heparosan具有与肝素类似的多糖骨架。因此，可作为肝素、硫酸乙酰肝素或者其他类似多糖的生物合成骨架。根据文献报道，已知的可以产heparosan的微生物有大肠杆菌K5和巴斯德菌D型，巴斯德菌D型产生的heparosan的分子质量为200～300kDa，而大肠杆菌产生的heparosan的分子量为3～150kDa，其分子质量更接近于肝素的分子量大小。近年以来，heparosan作为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。当前，肝素获得的方法有化学合成、酶法合成和动物组织提取法。酶法合成法和化学合成法尽管何以获得高纯度且特定结构的肝素，但由于其前体化合物极其昂贵，不可能满足大规模的使用需求。而目前医药级别的肝素均是从动物组织中提取得到，如从猪肠膜和牛肺组织中制备。但是随着全球对肝素的需求的不断增加，仅依赖动物组织来制备，无法满足需求，与此同时，疯牛病的发生以及2007年以来发生的硫酸软骨素及肝素污染事件，使人们对从动物体内获得肝素的安全性提出了质疑。为此，采用安全有效的方法合成肝素和硫酸乙酰肝素已成为需要首要解决的问题。这就迫切需求人们开始寻求新的肝素来源。合成Heparosan的细菌酶有2类：大肠杆菌K5的KfiA和KfiC，巴斯德菌D型PmHS1、PmHS2。利用以尿苷二磷酸(UDP)前体形式存在的单糖，即UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)、UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)相互交替合成肝素前体多糖链。基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求，本专利技术应用食品安全级的枯草芽孢杆菌发酵生产heparosan。本专利技术通过对heparosan的两个前体物质的合成途径进行模块化调控表达，进而引起胞内两个前体物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA浓度的变化，最终引起heparosan产量的变化，且易于调控前体物质的浓度来控制聚合物分子量，合成特定的heparosan聚合体。该专利技术操作过程简单，易于实现工业化大规模生产制备heparosan。
技术实现思路
本专利技术提供了一种产肝素前体的的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌中表达编码α-糖基转移酶的基因和编码β-糖基转移酶的基因，构建枯草芽孢杆菌代谢合成肝素前体的途径。所述重组枯草芽孢杆菌，还可以以模块化组装调控方式，分别对胞内肝素前体的两个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)的合成途径基因进行调控，提高肝素前体的产量，或实现不同分子量范围的Heparosan的生产。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因是来源于大肠杆菌K5(E.coliO10:K5:H4，E.coliK5)的KfiA和KfiC；KfiA的的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；KfiC的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一种实施方式中，编码所述α-糖基转移和β-糖基转移酶的基因是来源于巴斯德菌D型(PasteurellatypeD)的基因PmHS1和PmHS2。在本专利技术的一种实施方式中，所述UDP-N-GlcNAc的合成途径包括编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码变位酶的基因glmM；所述UDP-GlcUA的合成途径包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB。在本专利技术的一种实施方式中，表达两个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖和UDP-葡糖醛酸的合成途径基因以调控肝素前体的合成，包括表达基因glmU，或glmU及glmM，或tuaD，或tuaD及gtaB。在本专利技术的一种实施方式中，所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶可以来源于巴斯德菌属(PasteurellatypeD)、大肠杆菌(Escherichiacoli)或芽孢杆菌(Bacillus)。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB、磷酸葡萄糖变位酶的基因glmM和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的核苷酸序列分别为SEQIDNO.3-6所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因重组整合在基因组上进行诱导表达，启动子为木糖诱导型启动子Pxly。在本专利技术的一种实施方式中，以表达载体pP43NMK表达UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)合成途径的基因，启动子为组成型强启动子P43。本专利技术还提供了一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是以表达载体pP43NMK重组表达UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸合成途径的基因，并在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体表达glmU，或glmU和glmM；KfiA和KfiC整合在枯草芽孢杆菌基因组上串联表达，启动子为木糖诱导型强启动子Pxyl。在本专利技术的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体表达tuaD，或tuaD和gtaB，KfiA和KfiC整合在枯草芽孢杆菌基因组上串联表达，启动子为木糖诱导型强启动子Pxyl。本专利技术还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产肝素前体的方法，盐培养基：酵母粉20g/L，蔗糖/葡萄糖50g/L，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L，在37℃下，发酵48h获得平均分子量在40kDa至120kDa之间不同分布范围的Heparosan。在本专利技术的一种实施方式中，碳源采用蔗糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组上整合表达KfiA和KfiC，并过表达UDP-GlcNAc途径基因，产物平均分子量最高达到120000道尔顿。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组上整合表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产肝素前体的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是在枯草芽孢杆菌中表达编码α‑糖基转移酶的基因和编码β‑糖基转移酶的基因，构建合成肝素前体的途径。

【技术特征摘要】
1.一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是在枯草芽孢杆菌中表达编码α-糖基转移酶的基因和编码β-糖基转移酶的基因，构建合成肝素前体的途径；所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis168；编码所述α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因分别为KfiA和KfiC；编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因重组整合在枯草芽孢杆菌基因组上，置于木糖诱导型启动子Pxly下诱导表达；还分别表达了UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸的合成途径的基因，调控肝素前体的合成；所述UDP-N-乙酰氨基葡糖的合成途径包括编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU和编码变位酶的基因glmM；所述UDP-葡糖醛酸的合成途径包括编码UDP-葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，金鹏，张琳培，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32