一种芽孢杆菌的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。利用本发明专利技术所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80％以上。筛选获得的芽孢杆菌作为作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业生物
，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌的筛选方法及其应 用。
技术介绍
番前（Lycopersicon esculentum Mill)为我国普遍栽培的果蔬之一。据农业部 统计，2001年我国番茄栽培面积位居亚洲首位，世界第二。到目前为止，我国每年的番茄栽 培面积都稳定在110万hm 2左右。因此发展我国番茄生产具有重要的战略意义。 随着番茄栽培面积的不断扩大，栽培品种单一，栽培模式和栽培管理技术不当，番 茄病虫害也越来越严重，特别是在保护地栽培的番茄病虫害更为严重。其中番茄青枯病是 其中一种非常严重的病害之一，在我国南方各省市番茄种植区域均有严重发生。该病害是 由前科劳尔氏菌（R. solanacearum，EF smith，简称青枯菌）引起的一种世界范围的毁灭性 土传细菌病害，在高温、高湿的条件下容易爆发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，并且 在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球的农作物生产带来极大的威胁。该病害一 旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重 制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。 青枯菌是引起番茄、茄子、烟草、辣椒等多种经济作物青枯病的病原菌，但尚无有 效的方法控制其造成的危害。使用化学农药防治青枯病，不仅经济成本高，而且会污染环 境，危害人类健康。因此，利用具有环境友好、持续有效的生物防治技术对土传青枯病进行 防控，越来越受广大农业生产工作者的欢迎和关注。其中利用植物根际有益微生物防治土 传病害成为生物防治的重要研宄领域。利用植物根际有益微生物防治番茄青枯病，并且促 进番茄作物的生长，对番茄栽培乃至整个农作物栽培领域都具有十分重要的意义。 生防菌防控植物病害的关键是其能够在植物根际竞争定殖，尤其是有病原微生物 的存在于土壤或植物根部时更显得非常重要。室内平板试验中筛选得到的产拮抗物质能力 强的拮抗菌因其根际定殖能力差同样未必能达到理想的生物防控效果。但同样有研宄指出 根际定殖能力强的生防菌株未必就能够能取得很好的生防效果，并且大部分定殖能力强的 根际微生物属于革兰氏阴性菌，不利于用于农业生产应用及商业产品的开发。芽孢杆菌因 其能耐热抗逆、产内生芽孢，并具有抗逆能力强、功能性强、易储藏运输、分布广泛、防病稳 定性高等特点，为其在农业生产中表现出非芽孢杆菌所没有的优势，基于其开发的生防菌 剂，以及微生物有机肥等生防产品已成功投入使用并取得了良好的生防效果。但是有些芽 孢杆菌在室内平板的拮抗效果很好，但是在土壤中却不能发挥相应的作用。因此，有必要开 发和筛选出在根际定殖能力强兼有较强拮抗能力的新的菌株资源，从而为生物防控菌剂的 开发提供新的微生物资源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有较强根际定植能力和拮抗能力的微生物菌株的 筛选方法。 为达到以上目的，本专利技术提供了一种芽孢杆菌的筛选方法，所述方法包括菌株的 植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物诘抗能力筛选。 可选的，所述方法包括以下步骤： 1)芽孢杆菌的筛选：将采集的土壤样品稀释得到菌悬液，将菌悬液涂布于制备好 的LB培养基平板上，然后倒置于30°C培养箱中培养48h，挑取不同形态的、生长良好的单菌 落反复划线，纯化分离菌株，并将所获得的单菌落转接至LB培养基斜面上，30°C恒温培养 48h，筛选获得芽孢杆菌； 2)植株根际定殖能力筛选及病原微生物拮抗能力筛选：将筛选出来的芽孢杆菌 在LB培养基上划线培养后用无菌的磷酸缓冲液冲洗获得芽孢杆菌的混合菌悬液1，然后再 将混合菌悬液1接种至限菌条件下培养的植株根际，在植株根际培养一周后再将植株根际 的芽孢杆菌分离培养，筛选出数量最多的芽孢杆菌获得植株根际定殖能力强的菌株；再将 植株根际定殖能力强的芽孢杆菌与病原微生物进行室内平板对峙试验，挑选抑菌圈大的菌 株，即为对病原微生物具有强拮抗能力的菌株。 其中，所述土壤样品可以为生长在植物病原微生物病害严重的地区的健康作物植 株的根际土壤。例如，当所要筛选的芽孢杆菌为具有番茄青枯菌抑制能力的芽孢杆菌时，可 以取番茄青枯病连作障碍严重地区的健康番茄植株的根际土壤。 可选的，所述植株根际定植能力筛选包括以下步骤： 将限菌条件下培养的植株芽浸泡在所述芽孢杆菌的混合菌悬液1中处理 25-35min后置于装有无菌营养液PNS及石英砂的组培瓶中培养，培养的条件为25°C下每天 12h光照，12h黑暗，连续培养6-8d获得植株幼苗；收集所述植株幼苗的根并浸泡于磷酸缓 冲液中，充分振荡混匀获得菌悬液2,然后将所得菌悬液2稀释涂布于LB培养基上，待在黑 暗中30°C恒温培养48h后，将所得菌落用磷酸缓冲液冲洗得到菌悬液3,最后挑选数量最多 且不同菌落形态的菌株为根部定殖能力强的芽孢杆菌。 其中，优选利用相同的方法对菌悬液3再进行1-3轮植株根际定植能力筛选获得 根际定植能力强的芽孢杆菌。 其中，所述挑选数量最多的菌株指代挑选稀释涂布过程中，数量级最高的芽孢杆 菌。 可选的，所述平板对峙实验包括以下步骤： 用无菌牙签挑取所述根际定植能力强的芽孢杆菌的单菌落点接到NA平板上，培 养12h后，用装有病原微生物菌悬液的喷瓶喷1次，30°C培养24h后测定抑菌圈直径，其中， 在所述病原微生物菌悬液中有效活菌数含量为l〇 1(lCFU/ml。 可选的，可以对所述根际定植能力强的菌株进行进一步菌学鉴定，从而进行分类 筛选，例如可以通过鉴定进一步获得解淀粉芽孢杆菌菌株。 在本专利技术所提供的方法中，所述芽孢杆菌包括但不限于定植于作物根际的有病原 微生物拮抗能力的芽孢杆菌。 本专利技术还提供了利用所述筛选方法筛选得到的芽孢杆菌菌株。 可选的，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌。 本专利技术还提供了所述芽孢杆菌菌株在植物病原菌抑制中的应用。 可选的，所述应用包括制备含有所述芽孢杆菌菌株的菌剂，其中，所述菌剂含有所 述芽孢杆菌的培养液。 可选的，在所述菌剂中，芽孢杆菌的含量为1.0X109-1.0X101(lCFU/g。 可选的，所述应用包括抑制番茄青枯菌、马铃薯立枯病病原菌、黄瓜立枯病菌、油 菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花黄萎病菌或香蕉枯萎病菌。 可选的，所述应用为抑制番茄青枯菌，促进番茄生长。 利用本专利技术所提供的方法筛选得到的芽孢杆菌菌株不仅在平板培养时可高效抑 制微生物病原菌，而且在温室试验中其防治效果高达80%以上。筛选获得的芽孢杆菌作为 作物病害的有效生物防治材料，可以用于开发新的生物农药或生物防治菌剂，具有广阔的 应用前景。【附图说明】 图1为菌株T-5对番茄青枯病病原菌的抑制效果图。【具体实施方式】 下面将通过【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。 实施例1 实施例1用于说明本专利技术所述的芽孢杆菌菌株的筛选方法。 1)取江苏省南京市麒麟镇番茄青枯病连作障碍严重的农田中健康番茄植株的根 际土壤10g，加入到装有90ml无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分摇动30min，使得样品 与无菌水混和均匀，制得样品悬液。 2)将制得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述方法包括菌株的植物根际定殖能力筛选和菌株对病原微生物拮抗能力筛选。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭石勇，谭武贵，周亮，余佳玲，
申请(专利权)人：湖南泰谷生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43