一种大米转基因成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种大米转基因成分的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括：确定转基因成分、内源标准基因和外源标准基因；制备多重扩增引物；进行抽样并混合，得到混合样品；提取混合样品的基因组并加入外源标准基因，得到混合核酸；构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；获得待测样品中转基因成分的测序片段的数量、内源标准基因的测序片段的数量和外源标准基因的测序片段的数量；根据外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功并计算待测样品种中转基因成分的含量；根据转基因成分的含量判断待测样品中是否含有转基因成分。该方法能够同时定量检测待测样品中的多种转基因成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及。
技术介绍
大米是我国主要粮食，大米及其产品的转基因技术已成熟，且转基因大米及其产 品的销售需要严格审批，因此需要对转基因大米及其产品进行监管，转基因成分检测是转 基因监管的技术支撑。 现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法 主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR(PolymeraseChainReact ion，聚合酶链反 应)的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或芯片技术检测转基因成 分是否存在。 在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题中的一种： 转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要 对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为"非转基因"产品；一般检测的是共转 化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方 法进行检测会失效;检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，检测实验 室有少量转基因 DNA的污染或大米中有少数几粒转基因大米的污染，将待测样品将被误判 为转基因产品，从而产生错误的行政处罚。
技术实现思路
为了解决现有技术的问题，本专利技术实施例提供了一种大米转基因成分的检测方 法。所述技术方案如下： 本专利技术实施例提供了，所述方法包括： 确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述 待测样品的外源标准基因，所述待测样品为大米或大米产品； 制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区 域的多重扩增引物； 对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品； 提取所述混合样品的基因组； 向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸； 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增 产物构建高通量测序文库； 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组； 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、 所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量； 根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功； 若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量； 根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。 具体地，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源 插入旁侧序列中的至少一种。 具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。具体地，所述外源标准基因不存在于所有生物中。 具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数 量和所述内源标准基因的测序片段的数量均2 α?时，则实验成功；当所述外源标准基因的 测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量〈α?时，则实验失败;其中，α?为判 定阈值。 具体地，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任 意一种所述转基因成分的含量2 α2时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转 基因成分的含量<α2时，判定所述待测样品不含有转基因成分;其中，α2为判定阈值。 具体地，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为:第m种所述转基 因成分的含量的计算公式》其中，i为所述第m种转基因成分的 第i个测试区域，nl为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因 成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述 内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源 标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第j种所述测试区域的所 述测序片段的数量;N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。 具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于 1/100000。 本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本专利技术提供的检测方法可以在 不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可以一次性检测任意多种需要检测的转基因 成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可以实现定量检测，且检测结果几乎 没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一 步地详细描述。本专利技术实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生 物学技术人员所熟知的操作。本专利技术实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的 常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可以在市场上购买到。 实施例 通过农杆菌介导法将双丙氨酰磷抗性(Biolaphos resistance，Bar)基因导入日 本晴水稻品种，自交纯化3代后，获得改造的日本晴水稻品种种子，加工成为大米，作为本实 施例的待测植物品种。其中，日本晴水稻是标准的转基因水稻受体品种，几乎每个转基因实 验室都有日本晴水稻种子，本实施例中使用的日本晴水稻种子由江汉大学保存和繁殖。 大米转基因成分检测方法，具体步骤如下： 步骤1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待 测样品的外源标准基因，具体方法如下:待测样品为大米或大米产品，其中，大米产品为通 过大米加工而成的产品，如米粉，在本实施例中，待测样品为改造后的日本晴大米，转基因 成分、内源标准基因和外源标准基因均2 1个，转基因成分可以为外源功能基因、抗性标记 基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种，即通过转基因技术手段向日本晴 水稻品种中转入不存在于日本水稻品种中的外源核酸序列；内源标准基因为待测样品的基 因组中的单拷贝基因。在本实施例中，内源标准基因通过NCBI(http:// WWW.ncbi .nlm.nih.gov/)在待测样品基因组上比对时为单一序列；外源标准基因不存在于 所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为ERCC04基因，其在NCBI上同源比对 时，未发现同源序列，可以判定外源标准基因不存在于所有生物中。在本实施例中，转基因 成分共5种，内源标准基因3种，外源标准基因1种，其相关信息见表1，表1中所列转基因成分 不仅包括Bar基因，其为外源功能基因，还包括其他转基因成分，这些转基因成分在水稻中 广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。表1中的基因序列有两种表示方式， 一种是直接写出基因序列，另一种是NBCI的基因编号，表1中的测序区域中的数字代表碱基 的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。 表1为实施例一中被检测基因的相关信息与检测结果 表1中表示无。 步骤2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引 物，具体方法如下：多重扩增引物的获取过程如下：登录赛默飞世尔公司多重PCR引物在线设计网页 https ://ampl iseq · com/，在 "Application type" 选项选择 "DNA Hotspot designs (single-pool)"。若选择mu当前第1页1 2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大米转基因成分的检测方法，其特征在于，所述方法包括：确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述待测样品的外源标准基因，所述待测样品为大米或大米产品；制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区域的多重扩增引物；对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；提取所述混合样品的基因组；向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增产物构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：翟文学，方治伟，彭海，周俊飞，李论，胡长峰，李甜甜，高利芬，章伟雄，张静，卢龙，陈斌，李丽丽，陈利红，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，江汉大学，
类型：发明
国别省市：北京;11