一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法。本发明专利技术提供的CYP2D6_G4180C基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物。本发明专利技术提供的CYP2D6_G4180C基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了CYP2D6_G4180C基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降低不良反应具有非常重要的意义。

Primer and method for detecting CYP2D6_G4180C gene polymorphism

The invention belongs to the technical field of biological detection, in particular to a primer and a method for detecting the polymorphism of CYP2D6_G4180C gene. The present invention provides CYP2D6_G4180C gene polymorphism primers, including amplification primers and SNaPshot primer PCR nested PCR; the nested PCR primers including nested A primers and nested B PCR round round PCR primers. The present invention provides CYP2D6_G4180C gene polymorphism primers with good specificity, no cross reaction, the advantage of high accuracy, the detection of CYP2D6_G4180C gene polymorphism, gene directed to achieve individualized treatment, improve treatment effect has very important significance, reduce adverse reactions.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法。
技术介绍
CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22号染色体上，其含有9个外显子和8个内含子，总长为7kb左右，是一个完整的功能性基因。有研究发现，CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P基因与CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性，而且带有TATA盒，但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶（T），从而改变了读码框架，使转录提前终止；CYP2D8P基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达，只有CYP2D6在肝、肠、肾和人脑中表达。现代研究发现，肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2%，但是，它却参与代谢约25%的临床用药，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要是单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及多基因拷贝，这些变异使CYP2D6基因呈现多态性，并决定其代谢表型的多样性，使酶的活性表现为缺失、降低、正常或是增加等几种类型。杨汐等人发表了一篇题目为“CYP2D6基因多态性与他莫昔芬治疗”的论文，该论文表明不同基因型的CYP2D6对他莫昔芬的代谢不同，产生的活性代谢产物(4-羟基他莫昔芬和Endoxifen)浓度不同，其中PMs(含两个无效等位基因致CYP2D6活性缺失)血浆中活性代谢产物浓度最低，而UMs(含两个以上正常功能等位基因，即多基因拷贝致CYP2D6活性增强)血浆活性代谢产物浓度最高。因此，CYP2D6_的多态性研究对临床具有重要的意义，成为目前研究的热点。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物与方法，该引物检测CYP2D6基因G4180C(rs1135840)位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性高等优点，为CYP2D6_G4180C基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。本专利技术提供了一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5’-CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’（SEQIDNO.1）和下游引物5’-CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3’（SEQIDNO.2）；所述巢式B轮PCR扩增引物为：针对CYP2D6_G4180C的上游引物5’-GCAGCACTTCAGCTTCTCG-3’（SEQIDNO.3）和下游引物5’-TACCCCTGTCTCAAATGCG-3’（SEQIDNO.4）；所述SNaPshotPCR引物为：针对CYP2D6_G4180C的SNaPshotPCR引物5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3’（SEQIDNO.5）。另外，本专利技术还提供了一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法，包括如下步骤：S1提取DNA样品；S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对巢式A轮PCR扩增产物进行纯化；S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重PCR扩增；S4采用权利要求1所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，对扩增产物进行纯化；S5毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。进一步地，所述步骤S2中的巢式A轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：72℃3min；阶段4：返回到阶段2，24个循环；阶段5：72℃5min；阶段6：25℃保温。进一步地，所述步骤S3中的巢式B轮PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：58℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。进一步地，所述步骤S4中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃10s；阶段2：55℃5s；阶段3：60℃30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃保温。进一步地，所述步骤S5中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。除此之外，本专利技术提供的CYP2D6_G4180C基因多态性的引物在制备检测CYP2D6_G4180C基因多态性试剂中的用途。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有以下优势：本专利技术提供了一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了CYP2D6_G4180C基因多态性的检测，对实现基因导向性个体化治疗，不断提高治疗效果、降低不良反应具有非常重要的意义。附图说明图1为本专利技术提供的CYP2D6_G4180C的扩增片段；图2为CYP2D6_G4180C引物扩增产物的部分测序图；图3为样品的CYP2D6_G4180C基因多态性检测结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例一、引物本专利技术提供的引物如表1所示，包括巢式PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物，所述巢式B轮PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本专利技术提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。表1本专利技术提供的引物实施例二、引物的特异性将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：CYP2D6_G4180C基因特异引物于UCSC中进行Blast，无其它同源基因。CYP2D6_G4180C扩增片段位于chr22:42126391-42126685，长度为295bp，扩增序列如图1。使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与CYP2D6_G4180C基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPsh本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物，其特征在于：包括巢式PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5’‑ CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA‑3’和下游引物5’‑ CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG‑3’；所述巢式B轮PCR扩增引物为：针对CYP2D6_G4180C的上游引物5’‑GCAGCACTTCAGCTTCTCG ‑3’和下游引物5’‑TACCCCTGTCTCAAATGCG ‑3’；所述SNaPshot PCR引物为：针对CYP2D6_G4180C的SNaPshot PCR引物5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的引物，其特征在于：包括巢式PCR扩增引物和
SNaPshotPCR引物；所述巢式PCR扩增引物包括巢式A轮PCR扩增引物和巢式B轮PCR扩增引
物；所述巢式A轮扩增引物为：针对CYP2D6的上游引物5’-CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’和
下游引物5’-CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3’；所述巢式B轮PCR扩增引物为：针对CYP2D6_
G4180C的上游引物5’-GCAGCACTTCAGCTTCTCG-3’和下游引物5’-TACCCCTGTCTCAAATGCG-
3’；所述SNaPshotPCR引物为：针对CYP2D6_G4180C的SNaPshotPCR引物5’
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3’。
2.一种检测CYP2D6_G4180C基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2采用权利要求1所述的巢式A轮PCR扩增引物进行PCR扩增，对A轮PCR扩增产物进行纯
化；
S3以巢式A轮PCR扩增产物为模板采用权利要求1所述的巢式B轮PCR扩增引物进行多重
PCR扩增；
S4采用权利要求1所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，对扩增产物进行
纯化；
S5毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡昌明，梁耀铭，于世辉，赵薇薇，燕启江，罗锦霞，
申请(专利权)人：广州金域检测科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44