本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术利用荧光定量PCR方法替代普通PCR的方法筛选试猪，利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。本专利技术利用荧光定量PCR方法替代普通PCR的方法筛选试猪，利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确。【专利说明】_种用于支气管败血波氏杆菌实时焚光定量PGR方法的引 物
本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量 PCR方法的引物。
技术介绍
常规测定试猪中支气管败血波氏杆菌（Bordetellabronchiseptica，Bb)抗原的 方法是将从试猪身上采集的鼻拭子进行培养，再利用培养基分离鉴定，或者通过普通的PCR 方法进行检测。其中，培养基分离鉴定法在实际操作中非常繁复，且易受杂菌干扰影响；而 普通PCR方法相较于传统的分离鉴定检测法，虽然较为灵敏快捷，但是对目标菌在菌液中 的含量以及杂菌数量等方面要求较为严格，且有可能出现假阴性与假阳性等结果，使筛选 出的萎缩性鼻炎阴性猪或者感染猪出现偏差；同时，这种方法耗时费力。 本专利技术的目的在于：通过设计高特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法，测定 试猪鼻拭子中的支气管败血性波氏杆菌抗原含量，从而替代普通PCR的方法筛选试猪；并 利用荧光定量PCR溶解曲线吸收峰的特异性原理对样本进行检测，使试猪筛选更准确和高 效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：设计一对高特异性荧光定量PCR检测引物，便于优化支气管 败血波氏杆菌抗原检测，简化待测样本制备工作，从而提高抗原检测效率。 本专利技术的目的是这样实现的：一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方 法的引物，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5'_GCGCCTGCCCTATCCCG -3' 如 SEQ ID NO. 1 所示；下游引物：5' -GCCGCCCATTCGTAACATCG -3' 如 SEQ ID NO. 2 所示。 有益效果：本专利技术采用的高特异引物，使用荧光定量PCR法，在细菌含量在10时即 可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎 支气管败血波氏杆菌抗原，具有方便、准确、高灵敏度的特点。 【专利附图】【附图说明】 下面结合附图对本专利技术作进一步说明。 图1为普通PCR对Bb抗原检测图；附图1说明：如图1所示：I: IO8 CFU Bb菌体； 2: IO7 CFU Bb 菌体；3: IO6 CFU Bb 菌体；4: IO5 CFU Bb 菌体；5: IO4 CFU Bb 菌体；6: IO3 CFU Bb 菌体；7: IO2 CFU Bb 菌体；8:10 CFU Bb 菌体；9:1 CFU Bb 菌体；10 :Maker2000 ; 11 :阳性 对照。 【具体实施方式】 实施例1、一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，所述的引 物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5' -GCGCCTGCCCTATCCCG -3'如SEQ ID NO. 1所 示；下游引物：5'-GCCGCCCATTCGTAACATCG-3'如SEQIDN0·2所示。 具体实践验证：荧光定量PCR检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原(支气管败血波氏杆 菌）的方法步骤： 1抗原检测 1. 1制作鼻拭子将竹签一头缠绕脱脂棉，制作鼻拭子，不同日龄的试猪使用相应长度 的棉签，制作好的鼻拭子高压灭菌。 1. 2采样保定试猪，将制作好的鼻拭子轻轻旋转插入试猪鼻孔，避免误伤试猪，取 出鼻拭子放入事先分装的BHI培养基中； 1. 3菌液制备将接入鼻拭子的BHI培养基放入37°C摇床，在200rpm条件下，过夜培养 16h ;另取保存菌种Bb，经过复苏、菌落计数后梯度稀释为不同浓度作为阳性对照。 1. 4荧光定量PCR将培养好的菌液作为模板，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂 盒（TaKaRa公司）配制PCR体系，并使用荧光定量PCR仪（BioRad公司）进行反应。 1. 5观察荧光定量PCR结果，将待测样本与阴阳性对照的出峰时间与峰值大小进 行对比，记录结果。 其中，为便于使用荧光定量PCR方法鉴定支气管败血波氏杆菌抗原，包括待测抗 原样本制备与检测引物特异性；其中1、待测样本制备：使用鼻拭子采集试猪鼻腔内菌体， BHI液体培养；2、在波氏杆菌基因组高度保守区域内设计高特异性引物如下： Bb 上游引物：5'_ GCGCCTGCCCTATCCCG -3' ；Bb 下游引物：5'_ GCCGCCCATTCGTAACATCG - 3' ； (1) RT-PCR反应体系 SYBR Premix 12. 5ul Primer F Iul; Primer R Iul 模板 2ul Water 8ul 总体积 25ul (2) RT-PCR反应程序 Stage I:预变性 Raps :1 (95°C 30 秒） Stage 2: PCR 反应 Raps ：40 (95°C 5 秒）（56/59°C 30 秒） Stage 3: Melt Curve (3) 普通PCR反应体系 Taqmix 12.5ul Primer F 0. 5ul Primer R 0. 5ul 模板 2ul Water 9. 5ul 总体积 25ul (4)普通PCR反应程序 Stage 1:预变性 Raps ：1 (95°C 5min) Stage 2: PCR 反应 Raps ：30 (95°C 30 秒）（56/59°C 45 秒）（72°C 30 秒） Stage 3: 4 °C 实时荧光定量PCR所用的试剂盒为TAKARA公司生产。 2传统方法对比验证 2.1分离鉴定取步骤1.3制备的菌液，接入不同的分离培养基分离鉴定。 2. 2普通PCR鉴定使用与步骤1.4同样的模板，用普通PCR进行对比验证，普通 PCR结果见附图1。 验证结果显示：普通分离鉴定培养法中杂菌大量生长，遮盖了生长速度较慢的产 毒型巴氏杆菌，无法分离；普通PCR法鉴定灵敏度较低，在细菌含量大于IO 4CFU时才能检测 到；采用的荧光定量PCR法，在细菌含量在10时即可准确的检测出来，且不受杂菌干扰影 响；采用的实时荧光定量PCR法检测猪萎缩性鼻炎病原体抗原，具有方便，准确，高灵敏度 的特点。【权利要求】1. 一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的 引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5' - GCGCCTGCCCTATCCCG - 3'如SEQ ID NO. 1 所示；下游引物：5'-6〇1^〇^1'111^^六〇六1^6-3'如5￡0 10勵.2所示。【文档编号】C12R1/01GK104480219SQ201510033460【公开日】2015年4月1日 申请日期:2015年1月22日 优先权本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于支气管败血波氏杆菌实时荧光定量PCR方法的引物，其特征在于，所述的引物包括上、下游引物，具体如下：上游引物：5’‐GCGCCTGCCCTATCCCG‐3’如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‐GCCGCCCATTCGTAACATCG‐3’ 如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何海，郝成武，贺笋，李延涛，
申请(专利权)人：新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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